ثقافة الخلايا البكتيرية على مستوى الخلية الواحدة داخل الحويصلات العملاقة
Summary
نبرهن على ثقافة الخلايا الواحدة من البكتيريا داخل الحويصلات العملاقة (GVs). تم إعداد GVs التي تحتوي على الخلايا البكتيرية بواسطة طريقة نقل قطرات وتم تعطيلها على غشاء معتمد على الركيزة الزجاجية للمراقبة المباشرة للنمو البكتيري. وقد يكون هذا النهج أيضاقابلا للتكيف مع الخلايا الأخرى.
Abstract
قمنا بتطوير طريقة لزراعة الخلايا البكتيرية على مستوى الخلية الواحدة داخل الحويصلات العملاقة (GVs). ثقافة الخلايا البكتيرية مهمة لفهم وظيفة الخلايا البكتيرية في البيئة الطبيعية. بسبب التقدم التكنولوجي، يمكن الكشف عن وظائف الخلايا البكتيرية المختلفة على مستوى خلية واحدة داخل مساحة محصورة. GVs هي مقصورات كروية صغيرة الحجم تتكون من جزيئات الدهون أمفيليليك ويمكن أن تعقد مواد مختلفة، بما في ذلك الخلايا. في هذه الدراسة، تم تغليف خلية بكتيرية واحدة في 10-30 ميكرومتر GVs بواسطة طريقة نقل قطرات وGVs التي تحتوي على الخلايا البكتيرية تم تعطيلها على غشاء معتمد على الركيزة الزجاجية. طريقتنا مفيدة لمراقبة النمو في الوقت الحقيقي من البكتيريا واحدة داخل GVs. نحن المستزرعة الإشريكية القولونية (E.القولونية)الخلايا كنموذج داخل GVs، ولكن هذه الطريقة يمكن تكييفها لأنواع الخلايا الأخرى. يمكن استخدام أسلوبنا في المجالات العلمية والصناعية للميكروبيولوجيا، والبيولوجيا، والتكنولوجيا الحيوية، والبيولوجيا التركيبية.
Introduction
وقد حظيت ثقافة الخلايا البكتيرية على مستوى الخلية الواحدة باهتمام متزايد. زراعة الخلايا البكتيرية على مستوى الخلية الواحدة داخل مساحة محصورة يمكن أن توضحالوظائف البكتيرية مثل تقلب الفينوتيبيك 1،2،3،4،سلوك الخلية5، 6 , 7 , 8 , 9، ومقاومة المضادات الحيوية10،11. بسبب التطورات الأخيرة في تقنيات الثقافة، يمكن تحقيق ثقافة البكتيريا واحدة داخل مساحةمحصورة، كما هو الحال في رقاقة جيدة 4،7،8،هلام قطرات12،13 ، والمياه في النفط (W /O) قطرات 5،11. ولتعزيز فهم الخلايا البكتيرية الوحيدة أو استخدامها، يلزم إجراء المزيد من التطورات التقنية لتقنيات الزراعة.
الحويصلات التي تحاكي غشاء الخلية البيولوجية هي مقصورات كروية تتكون من جزيئات أمفيليليك ويمكن أن تعقد مواد مختلفة. وتصنف الحويصلات حسب الحجم وتشمل الحويصلات الصغيرة (SVs، القطر <؛ 100 نانومتر)، والحويصلات الكبيرة (LVs، 1 ميكرومتر). وتستخدم عادة SVs أو LVs كناقلات المخدرات بسبب تقاربها مع غشاء الخلية البيولوجية14. وقد استخدمت أيضا GVs كنظام مفاعل لبناء protocells15 أو الخلايا الاصطناعية16. تم الإبلاغ عن تغليف الخلايا البيولوجية في GVs17،18،وبالتالي تظهر GVs إمكانات كنظام زراعة الخلايا عند دمجها مع نظام المفاعل.
هنا، جنبا إلى جنب مع شريط فيديو من الإجراءات التجريبية، ونحن نصف كيف يمكن استخدام GVs كسفن ثقافة الخلية رواية19. تم إجراء GVs التي تحتوي على البكتيريا من قبل طريقة نقل قطرات20 ثم تم تعطيلها على غشاء معتمد على زجاج الغلاف. استخدمنا هذا النظام لمراقبة النمو البكتيري على مستوى الخلية الواحدة داخل GVs في الوقت الحقيقي.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، ونحن نصف طريقة لزراعة الخلايا البكتيرية على مستوى خلية واحدة داخل GVs. تتضمن هذه الطريقة البسيطة تشكيل GVs التي تحتوي على خلايا بكتيرية على مستوى الخلية الواحدة باستخدام طريقة نقل قطرات. بالمقارنة مع النهج الأخرى للحصول على GVs التي تحتوي على الخلايا البكتيرية، ولهذه الطريقة ميزتين: ‘1’ م?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من خلال مبادرة رائدة للباحثين الشباب الممتازين (LEADER، رقم 16812285) من وزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا (MEXT) في اليابان، وهي منحة مساعدة للبحوث العلمية الشابة (رقم 18K18157، 16K21034) من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) إلى M.M.، والمنحة في المعونة من MEXT إلى K.K. (رقم 17H06417، 17H06413).
Materials
| Bactotryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 032-21921 | |
| Cover glass (18 × 18 mm) | Matsunami Glass Ind. | C018181 | thickness 0.13–0.17 mm |
| Cover glass (30 × 40 mm) | Matsunami Glass Ind. | custom-order | thickness 0.25–0.35 mm |
| Desktop centrifuge | Hi-Tech Co. | ATT101 | swing rotor type |
| Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) | Nitoms | T4613 | |
| Glass vial | AS ONE | 6-306-01 | Durham fermentation tube |
| Glucose | Wako Pure Chemicals | 049-31165 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| Methanol | Wako Pure Chemicals | 133-16771 | |
| Microscopic heating stage system | TOKAI HIT | TP-110R-100 | |
| Mineral oil | Nacalai Tesque | 23334-85 | |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Objective lens | Olympus | LUCPLFLN 40×/0.6 NA | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids | 610005 | pore size 100 nm |
| sCMOS camera | Andor | Zyla 4.2 plus | |
| Sodium chloride | Wako Pure Chemicals | 191-01665 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemicals | 196-00015 | |
| Ultrasonic bath | AS ONE | ASU-3D | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212750 | |
| 0.6 mL lidded plastic tube | Watson | 130-806C | |
| 1.5 mL lidded plastic tube | Sumitomo Bakelite Co. | MS4265-M | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline | Avanti Polar Lipids | 850457P | POPC |
| 1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti Polar Lipids | 880129P | Biotin-PEG-DSPE |
References
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962-1965 (2005).
- Eldar, A., Elowitz, M. B. Functional roles for noise in genetic circuits. Nature. 467, 167-173 (2010).
- Hashimoto, M., et al. Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).
- Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).
- Christopher, M., Waters, B. L. B. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
- Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. On-chip culture system for observation of isolated individual cells. Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).
- Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. Cell shape dynamics in Escherichia coli. Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
- Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).
- Zengler, K., et al. Cultivating the uncultured. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).
- Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).
- Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).
- Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. Synthesizing life. Nature. 409, 387-390 (2001).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles. Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).
- Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique. ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).
- Morita, M., Katoh, K., Noda, N. Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures. ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 812, 55-65 (1985).
- Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).
- Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles. Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).
- Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).
- Kurokawa, C., et al. DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).
- Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).
- Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
- Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors. Interface Focus. 8, 20180024 (2018).
- Elani, Y., et al. Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules. Scientific Reports. 8, 4564 (2018).
