Bakterielle Zellkultur auf der Einzelzellebene im Riesenvesikel
Summary
Wir zeigen die einzellige Kultur von Bakterien in riesigen Vesikeln (GVs). GVs, die Bakterienzellen enthalten, wurden nach der Tröpfchentransfermethode hergestellt und auf einer unterstützten Membran auf einem Glassubstrat zur direkten Beobachtung des Bakterienwachstums immobilisiert. Dieser Ansatz kann auch an andere Zellen angepasst werden.
Abstract
Wir haben eine Methode zur Kultivierung von Bakterienzellen auf einzelzelliger Ebene in Riesigen Vesikeln (GVs) entwickelt. Bakterielle Zellkultur ist wichtig für das Verständnis der Funktion von Bakterienzellen in der natürlichen Umgebung. Aufgrund des technologischen Fortschritts können verschiedene bakterielle Zellfunktionen auf einzelzeller Ebene auf engstem Raum aufgedeckt werden. GVs sind kugelförmige mikrogroße Kompartimente, die aus amphiphilen Lipidmolekülen bestehen und verschiedene Materialien, einschließlich Zellen, aufnehmen können. In dieser Studie wurde eine einzelne Bakterienzelle durch die Tröpfchenübertragungsmethode in 10–30 m GVs eingekapselt und die GVs, die Bakterienzellen enthielten, auf einer unterstützten Membran auf einem Glassubstrat immobilisiert. Unsere Methode ist nützlich, um das Echtzeitwachstum einzelner Bakterien in GVs zu beobachten. Wir kultivierten Escherichia coli (E. coli) Zellen als Modell innerhalb von GVs, aber diese Methode kann an andere Zelltypen angepasst werden. Unsere Methode kann in den Bereichen Mikrobiologie, Biologie, Biotechnologie und Synthetische Biologie eingesetzt werden.
Introduction
Die Kultur der Bakterienzellen auf einzelzeller Ebene hat zunehmend Beachtung gefunden. Die Kultivierung von Bakterienzellen auf einzelzeller Ebene innerhalb eines begrenzten Raumes kann bakterielle Funktionen wie phänotypische Variabilität1,2,3,4, Zellverhalten5, 6 , 7 , 8 , 9und Antibiotikaresistenz10,11. Aufgrund der jüngsten Fortschritte in Kulturtechniken kann die Kultur einzelner Bakterien auf engstem Raum erreicht werden, z. B. in einem Well-Chip4,7,8, Geltröpfchen12,13 , und Wasser-in-Öl (W/O) Tröpfchen5,11. Um das Verständnis oder die Nutzung einzelner Bakterienzellen zu fördern, sind weitere technische Entwicklungen der Kultivierungstechniken erforderlich.
Vesikel, die die biologische Zellmembran imitieren, sind kugelförmige Kompartimente, die aus amphiphilen Molekülen bestehen und verschiedene Materialien aufnehmen können. Vesikel werden nach Größe klassifiziert und umfassen kleine Vesikel (SVs, Durchmesser < 100 nm), große Vesikel (LVs, 1 m). SVs oder LVs werden aufgrund ihrer Affinität zur biologischen Zellmembran14häufig als Arzneimittelträger eingesetzt. GVs wurden auch als Reaktorsystem für den Bau von Protozellen15 oder künstlicheZellen16verwendet. Die Verkapselung biologischer Zellen inGVs wurde 17,18berichtet, und somit zeigen GVs in Kombination mit dem Reaktorsystem Potenzial als Zellkultursystem.
Hier beschreiben wir zusammen mit einem Video von experimentellen Verfahren, wie VVs als neuartige Zellkulturgefäße verwendet werden können19. GVs, die Bakterien enthalten, wurden nach der Tröpfchentransfermethode20 hergestellt und dann auf einer unterstützten Membran auf einem Deckglas immobilisiert. Wir nutzten dieses System, um das Bakterienwachstum auf einzelzelliger Ebene in GVs in Echtzeit zu beobachten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir eine Methode zur Kultivierung von Bakterienzellen auf einzelzeller Ebene innerhalb von GVs. Bei dieser einfachen Methode werden GVs gebildet, die Bakterienzellen auf einzelzeller Ebene enthalten, indem die Tröpfchenübertragungsmethode verwendet wird. Im Vergleich zu anderen Ansätzen zur Gewinnung von GVs, die Bakterienzellen enthalten, hat diese Methode zwei Vorteile: (i) es ist leicht zu entwickeln, und (ii) ein kleines Volumen (2 l) der Probenlösung ist erforderlich, um die GVs vorzubereiten. D…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von einer Leading Initiative for Excellent Young Researchers (LEADER, No. 16812285) des Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT) japans unterstützt, einem Stipendium für junge Wissenschaftlerforschung (Nr. 18K18157, 16K21034) von der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) bis M.M., und Grant-in-Aid von MEXT bis K.K. (Nr. 17H06417, 17H06413).
Materials
| Bactotryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 032-21921 | |
| Cover glass (18 × 18 mm) | Matsunami Glass Ind. | C018181 | thickness 0.13–0.17 mm |
| Cover glass (30 × 40 mm) | Matsunami Glass Ind. | custom-order | thickness 0.25–0.35 mm |
| Desktop centrifuge | Hi-Tech Co. | ATT101 | swing rotor type |
| Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) | Nitoms | T4613 | |
| Glass vial | AS ONE | 6-306-01 | Durham fermentation tube |
| Glucose | Wako Pure Chemicals | 049-31165 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| Methanol | Wako Pure Chemicals | 133-16771 | |
| Microscopic heating stage system | TOKAI HIT | TP-110R-100 | |
| Mineral oil | Nacalai Tesque | 23334-85 | |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Objective lens | Olympus | LUCPLFLN 40×/0.6 NA | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids | 610005 | pore size 100 nm |
| sCMOS camera | Andor | Zyla 4.2 plus | |
| Sodium chloride | Wako Pure Chemicals | 191-01665 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemicals | 196-00015 | |
| Ultrasonic bath | AS ONE | ASU-3D | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212750 | |
| 0.6 mL lidded plastic tube | Watson | 130-806C | |
| 1.5 mL lidded plastic tube | Sumitomo Bakelite Co. | MS4265-M | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline | Avanti Polar Lipids | 850457P | POPC |
| 1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti Polar Lipids | 880129P | Biotin-PEG-DSPE |
References
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962-1965 (2005).
- Eldar, A., Elowitz, M. B. Functional roles for noise in genetic circuits. Nature. 467, 167-173 (2010).
- Hashimoto, M., et al. Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).
- Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).
- Christopher, M., Waters, B. L. B. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
- Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. On-chip culture system for observation of isolated individual cells. Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).
- Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. Cell shape dynamics in Escherichia coli. Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
- Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).
- Zengler, K., et al. Cultivating the uncultured. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).
- Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).
- Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).
- Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. Synthesizing life. Nature. 409, 387-390 (2001).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles. Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).
- Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique. ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).
- Morita, M., Katoh, K., Noda, N. Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures. ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 812, 55-65 (1985).
- Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).
- Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles. Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).
- Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).
- Kurokawa, C., et al. DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).
- Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).
- Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
- Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors. Interface Focus. 8, 20180024 (2018).
- Elani, Y., et al. Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules. Scientific Reports. 8, 4564 (2018).
