巨小胞内部の単細胞レベルにおける細菌細胞培養
Summary
我々は、巨大な小胞(GV)内の細菌の単細胞培養を実証する。細菌細胞を含むGVは液滴転写法により調製し、ガラス基板上の支持膜上に固定化し、細菌増殖を直接観察した。このアプローチは、他の細胞にも適応可能である。
Abstract
我々は、巨大小胞(GV)内の単細胞レベルで細菌細胞を培養する方法を開発した。細菌細胞培養は、自然環境における細菌細胞の機能を理解するために重要である。技術の進歩により、限られた空間内の単細胞レベルで様々な細菌細胞機能が明らかになります。GVは、親和性脂質分子からなる球状の微小サイズのコンパートメントで、細胞を含む様々な材料を保持することができます。本研究では、液滴転写法により10~30μm GVに単一の細菌細胞を封入し、細菌細胞を含むGVをガラス基板上の支持膜上に固定化した。本手法は、GV内の単一細菌のリアルタイム増殖を観察するのに有用である。大腸菌(大腸菌)細胞をGV内のモデルとして培養したが、この方法は他の細胞型に適応できる。微生物学、生物学、バイオテクノロジー、合成生物学の科学・産業分野で活用できます。
Introduction
単細胞レベルでの細菌細胞の培養が注目を集めています。限られた空間内の単細胞レベルで細菌細胞を培養すると、表現型変動性1、2、3、4、細胞挙動5などの細菌機能を解明できる。6,7,8,9、および抗生物質耐性10、11。近年の培養技術の進歩により、単一細菌の培養は、ウェルチップ4、7、8、ゲル液滴12、13などの限られた空間内で達成することができる。、および水中油(W/O)液滴5、11.単一細菌細胞の理解や利用を促進するためには、栽培技術のさらなる技術開発が必要である。
生体細胞膜を模倣する小胞は、両生類分子からなる球状の区画であり、様々な物質を保持することができる。小胞はサイズに応じて分類され、小さな小胞(SV、直径<100 nm)、大きな小胞(NEV、1 μm)が含まれます。SVまたはNEVは、生体細胞膜14に対する親和性のために薬物担体として一般的に使用される。GVは、原始電池15または人工細胞16の構築のための原子炉システムとしても使用されている。生体細胞をGVに封入すると17、18、したがってGVは、反応器系と組み合わせると細胞培養システムとしての可能性を示す。
ここでは、実験手順のビデオと共に、GVを新規細胞培養器19として使用する方法について説明する。細菌を含むGVは、液滴転写方法20により作製され、次いでカバーガラス上の支持膜上に固定化した。このシステムを用いて、GV内部の単細胞レベルで細菌の増殖をリアルタイムで観察した。
Protocol
1. 液滴転写法による細菌細胞を含むGVの調製 1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC、 10 mM、1 mL)および1,2-ジステアロイル-snグリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[ビオチニル(ポリエチルネグリコール)-2000](ビオチン-PEG-DSPE、0.1mM、1mL)メタノール溶液(2/1、v/v)を保存し、-20°Cで在庫を保存します。 脂質含有油溶液の調製 POPC溶液の20μLとビ?…
Representative Results
液滴転写法を用いて単一細菌細胞を含むGVを生成する簡単な方法を提示する(図1)。図1aは、細菌を含むGVの沈殿物の概略図を示す。細菌を含むW/O液滴は、遠心分離によって油水(脂質単層)界面を越えてGVを形成する。スクロース(内部水溶液)とブドウ糖(外水溶液)の密度の違いは、W/O液滴の油水界面の交差を助けます。これら?…
Discussion
ここでは、GV内部の単細胞レベルで細菌細胞を培養する方法について述べている。この簡易方法は、液滴転写法を用いて単細胞レベルで細菌細胞を含むGVを形成することを含む。細菌細胞を含むGVを得るための他のアプローチと比較して、この方法には2つの利点があります:(i)開発が容易であり、(ii)GVを調作するためにサンプル溶液の少量(2μL)が必要である。細菌細胞を含むGVを用いた液滴転写…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、文部科学省の優秀若手研究者のためのリーディング・イニシアティブ(第16812285号)、若手科学者研究助成金(No.18K18157,16K21034)の支援を受けました。日本学術振興会(JSPS)からM.M.、文部科学省から株式会社への助成金(第17H06417号、17H06413)。
Materials
| Bactotryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 032-21921 | |
| Cover glass (18 × 18 mm) | Matsunami Glass Ind. | C018181 | thickness 0.13–0.17 mm |
| Cover glass (30 × 40 mm) | Matsunami Glass Ind. | custom-order | thickness 0.25–0.35 mm |
| Desktop centrifuge | Hi-Tech Co. | ATT101 | swing rotor type |
| Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) | Nitoms | T4613 | |
| Glass vial | AS ONE | 6-306-01 | Durham fermentation tube |
| Glucose | Wako Pure Chemicals | 049-31165 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| Methanol | Wako Pure Chemicals | 133-16771 | |
| Microscopic heating stage system | TOKAI HIT | TP-110R-100 | |
| Mineral oil | Nacalai Tesque | 23334-85 | |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Objective lens | Olympus | LUCPLFLN 40×/0.6 NA | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids | 610005 | pore size 100 nm |
| sCMOS camera | Andor | Zyla 4.2 plus | |
| Sodium chloride | Wako Pure Chemicals | 191-01665 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemicals | 196-00015 | |
| Ultrasonic bath | AS ONE | ASU-3D | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212750 | |
| 0.6 mL lidded plastic tube | Watson | 130-806C | |
| 1.5 mL lidded plastic tube | Sumitomo Bakelite Co. | MS4265-M | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline | Avanti Polar Lipids | 850457P | POPC |
| 1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti Polar Lipids | 880129P | Biotin-PEG-DSPE |
References
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Cite This Article
Morita, M., Ota, Y., Katoh, K., Noda, N. Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles. J. Vis. Exp. (146), e59555, doi:10.3791/59555 (2019).