Dev veziküller Içinde tek hücreli seviyede bakteriyel hücre kültürü
Summary
Biz dev veziküller (GVs) içinde bakteri tek hücreli kültürü göstermektedir. Bakteriyel hücreler içeren GVs damlacık transfer yöntemi ile hazırlanmıştır ve bakteriyel büyüme doğrudan gözlem için bir cam substrat üzerinde desteklenen bir membran immobilize edildi. Bu yaklaşım, diğer hücrelere de uyarlanabilir.
Abstract
Biz dev veziküller (GVs) içinde tek hücreli düzeyde bakteriyel hücreler kültür için bir yöntem geliştirdik. Bakteriyel hücre kültürü, doğal ortamda bakteriyel hücrelerin fonksiyonunu anlamak için önemlidir. Teknolojik gelişmeler nedeniyle, çeşitli bakteriyel hücre fonksiyonları sınırlı bir alan içinde tek hücreli düzeyde ortaya olabilir. GVs, amphiphilik lipid moleküllerinden oluşan küresel mikro boyutlu bölmeler ve hücreler de dahil olmak üzere çeşitli malzemeler tutabilir. Bu çalışmada, tek bir bakteriyel hücre, damlacık transfer yöntemi ile 10 – 30 μm GVs içine kapsüllenmiş ve bakteriyel hücreler içeren GVs cam substrat üzerinde desteklenen bir membran üzerinde immobilize edildi. Bizim yöntemi GVs içinde tek bakterilerin gerçek zamanlı büyüme gözlem için yararlıdır. Biz GVs içinde bir model olarak Escherichia coli (E. coli) hücreleri kültürlü, ama bu yöntem diğer hücre türlerine adapte edilebilir. Bizim yöntemi Mikrobiyoloji, biyoloji, biyoteknoloji ve sentetik biyoloji bilim ve sanayi alanlarında kullanılabilir.
Introduction
Tek hücreli düzeyde bakteriyel hücrelerin kültürü artan ilgi aldı. Sınırlı bir alan içinde tek hücreli düzeyde bakteriyel hücreleri kültür fenotip değişkenlik1,2,3,4, hücre davranışı5gibi bakteriyel fonksiyonları aydınlatmak olabilir, 6 , 7 , 8 , 9ve antibiyotik direnci10,11. Kültür tekniklerindeki son gelişmeler nedeniyle, tek bakterilerin kültürü, bir iyi çip4,7,8, jel damlacık12,13 gibi kapalı bir alanda elde edilebilir ve yağ içinde su (W/O) damlacık5,11. Tek bakteriyel hücrelerin anlayış veya kullanımını teşvik etmek için, yetiştirme tekniklerinin daha fazla teknik gelişimi gereklidir.
Biyolojik hücre membranı taklit eden veziküller, amphiphilik moleküllerden oluşan küresel bölmeler olup çeşitli materyalleri tutabilir. Veziküller boyutuna göre sınıflandırılır ve küçük veziküller (SVs, çapı < 100 Nm), büyük veziküller (LVs, 1 μm) içerir. SVs veya LVs yaygın olarak biyolojik hücre membranı14için kendi yakınlık nedeniyle uyuşturucu taşıyıcıları olarak kullanılır. GVS Ayrıca belirleyebiliyorlar15 veya suni hücreler16inşası için bir reaktör sistemi olarak kullanılmıştır. Biyolojik hücrelerin GVS içine kapsülleme,17,18bildirilmiştir ve böylece reaktör sistemi ile kombine edildiğinde bir hücre kültürü sistemi olarak potansiyel GVS göstermek.
Burada, deneysel prosedürler bir video ile birlikte, biz nasıl GVs yeni hücre kültürü gemiler olarak kullanılabilir tarif19. Bakteriler içeren GVs damlacık transfer yöntemi20 tarafından yapılmıştır ve daha sonra bir kapak camında desteklenen bir membran üzerinde immobilize edildi. Bu sistemi, gerçek zamanlı olarak GVs içindeki tek hücreli seviyede bakteriyel büyümesini gözlemlemek için kullandık.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, biz GVs içinde tek hücreli düzeyde bakteriyel hücreler kültür için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu basit yöntem, damlacık Transfer yöntemini kullanarak tek hücreli düzeyde bakteriyel hücreler içeren GVs oluşturma içerir. Bakteriyel hücreler içeren GVs almak için diğer yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında, bu yöntem iki avantajı vardır: (i) geliştirmek kolaydır, ve (ii) örnek çözümün küçük bir hacmi (2 μL) GVs hazırlamak için gereklidir. Bakteriyel hücreler içeren…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Japonya ‘nın eğitim, kültür, spor, bilim ve teknoloji (MEXT) Bakanlığından mükemmel genç araştırmacılar (lıder, No. 16812285) için önde gelen bir girişim tarafından destekleniyordu (No. 18K18157, 16K21034) genç bilim adamı araştırmaları için hibe-in-Aid Japonya ‘dan m. ‘ ye bilim (JSPS) tanıtımı için ve MEXT ‘den K.K. ‘ye (No. 17H06417, 17H06413) Grant-ın-Aid.
Materials
| Bactotryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 032-21921 | |
| Cover glass (18 × 18 mm) | Matsunami Glass Ind. | C018181 | thickness 0.13–0.17 mm |
| Cover glass (30 × 40 mm) | Matsunami Glass Ind. | custom-order | thickness 0.25–0.35 mm |
| Desktop centrifuge | Hi-Tech Co. | ATT101 | swing rotor type |
| Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) | Nitoms | T4613 | |
| Glass vial | AS ONE | 6-306-01 | Durham fermentation tube |
| Glucose | Wako Pure Chemicals | 049-31165 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| Methanol | Wako Pure Chemicals | 133-16771 | |
| Microscopic heating stage system | TOKAI HIT | TP-110R-100 | |
| Mineral oil | Nacalai Tesque | 23334-85 | |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Objective lens | Olympus | LUCPLFLN 40×/0.6 NA | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids | 610005 | pore size 100 nm |
| sCMOS camera | Andor | Zyla 4.2 plus | |
| Sodium chloride | Wako Pure Chemicals | 191-01665 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemicals | 196-00015 | |
| Ultrasonic bath | AS ONE | ASU-3D | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212750 | |
| 0.6 mL lidded plastic tube | Watson | 130-806C | |
| 1.5 mL lidded plastic tube | Sumitomo Bakelite Co. | MS4265-M | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline | Avanti Polar Lipids | 850457P | POPC |
| 1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti Polar Lipids | 880129P | Biotin-PEG-DSPE |
References
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962-1965 (2005).
- Eldar, A., Elowitz, M. B. Functional roles for noise in genetic circuits. Nature. 467, 167-173 (2010).
- Hashimoto, M., et al. Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).
- Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).
- Christopher, M., Waters, B. L. B. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
- Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. On-chip culture system for observation of isolated individual cells. Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).
- Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. Cell shape dynamics in Escherichia coli. Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
- Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).
- Zengler, K., et al. Cultivating the uncultured. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).
- Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).
- Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).
- Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. Synthesizing life. Nature. 409, 387-390 (2001).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles. Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).
- Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique. ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).
- Morita, M., Katoh, K., Noda, N. Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures. ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 812, 55-65 (1985).
- Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).
- Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles. Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).
- Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).
- Kurokawa, C., et al. DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).
- Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).
- Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
- Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors. Interface Focus. 8, 20180024 (2018).
- Elani, Y., et al. Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules. Scientific Reports. 8, 4564 (2018).
