Culture cellulaire bactérienne au niveau unicellulaire à l'intérieur des vésicules géantes
Summary
Nous démontrons la culture unicellulaire des bactéries à l’intérieur des vésicules géantes (GM). Les GV contenant des cellules bactériennes ont été préparés par la méthode de transfert de gouttelettes et ont été immobilisés sur une membrane soutenue sur un substrat en verre pour l’observation directe de la croissance bactérienne. Cette approche peut également être adaptable à d’autres cellules.
Abstract
Nous avons mis au point une méthode de culture des cellules bactériennes au niveau unicellulaire à l’intérieur des vésicules géantes (GV). La culture cellulaire bactérienne est importante pour comprendre la fonction des cellules bactériennes dans l’environnement naturel. En raison des progrès technologiques, diverses fonctions de cellules bactériennes peuvent être révélées au niveau d’une seule cellule à l’intérieur d’un espace confiné. Les VÉHICULES sont des compartiments sphériques de microtaille composée de molécules lipidiques amphiphiles et peuvent contenir divers matériaux, y compris des cellules. Dans cette étude, une seule cellule bactérienne a été encapsulée en 10 à 30 millions de véhicules par la méthode de transfert de gouttelettes et les GV contenant des cellules bactériennes ont été immobilisés sur une membrane supportée sur un substrat de verre. Notre méthode est utile pour observer la croissance en temps réel des bactéries simples à l’intérieur des VÉHICULES lourds. Nous avons cultivé des cellules Escherichia coli (E. coli) comme modèle à l’intérieur des GV, mais cette méthode peut être adaptée à d’autres types de cellules. Notre méthode peut être utilisée dans les domaines scientifiques et industriels de la microbiologie, de la biologie, de la biotechnologie et de la biologie synthétique.
Introduction
La culture des cellules bactériennes au niveau unicellulaire a reçu une attention croissante. Cultiver des cellules bactériennes au niveau unicellulaire à l’intérieur d’un espace confiné peut élucider des fonctions bactériennes telles que la variabilité phénotypique1,2,3,4, comportement cellulaire5, 6 Annonces , 7 Annonces , 8 Annonces , 9, et résistance aux antibiotiques10,11. En raison des progrès récents dans les techniques de culture, la culture des bactéries simples peut être réalisée à l’intérieur d’un espace confiné, comme dans un puits-puce4,7,8, gouttelette de gel12,13 , et gouttelette d’eau dans l’huile (W/O)5,11. Pour promouvoir la compréhension ou l’utilisation de cellules bactériennes uniques, d’autres développements techniques des techniques de culture sont nécessaires.
Les vésicules qui imitent la membrane cellulaire biologique sont des compartiments sphériques composés de molécules amphiphiles et peuvent contenir divers matériaux. Les vésicules sont classées en fonction de leur taille et comprennent les petites vésicules (SVs, diamètre et 100 nm), les grandes vésicules (LV, ‘lt;1 ‘m) et les vésicules géantes (GV, ‘gt;1 ‘m). Les SV ou LVs sont couramment utilisés comme porteurs de médicaments en raison de leur affinité avec la membrane cellulaire biologique14. Les GV ont également été utilisés comme système de réacteur pour la construction de protocellules15 ou de cellules artificielles16. L’encapsulation des cellules biologiques dans les GV a été rapportée17,18, et donc les GV montrent le potentiel comme un système de culture cellulaire lorsqu’il est combiné avec le système de réacteur.
Ici, avec une vidéo des procédures expérimentales, nous décrivons comment les GV peuvent être utilisés comme nouveaux navires de culture cellulaire19. Les GV contenant des bactéries ont été fabriqués par la méthode de transfert de gouttelettes20 et ont ensuite été immobilisés sur une membrane supportée sur un verre de couverture. Nous avons utilisé ce système pour observer la croissance bactérienne au niveau unicellulaire à l’intérieur des VÉHICULES électriques en temps réel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous décrivons une méthode pour cultiver des cellules bactériennes au niveau unicellulaire à l’intérieur des VÉHICULES lourds. Cette méthode simple consiste à former des GV contenant des cellules bactériennes au niveau unicellulaire en utilisant la méthode de transfert de gouttelettes. Par rapport à d’autres approches pour l’obtention de VÉHICULES uvrifs contenant des cellules bactériennes, cette méthode présente deux avantages : (i) elle est facile à développer, et (ii) un petit volume (2 l) de la …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une initiative de premier plan pour d’excellents jeunes chercheurs (LEADER, no 16812285) du ministère de l’Éducation, de la Culture, des Sports, des Sports et de la Technologie (MEXT) du Japon, une subvention d’aide pour la recherche sur les jeunes scientifiques (No. 18K18157, 16K21034) de la Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) à M.M., et Grant-in-Aid de MEXT à K.K. (No. 17H06417, 17H06413).
Materials
| Bactotryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 032-21921 | |
| Cover glass (18 × 18 mm) | Matsunami Glass Ind. | C018181 | thickness 0.13–0.17 mm |
| Cover glass (30 × 40 mm) | Matsunami Glass Ind. | custom-order | thickness 0.25–0.35 mm |
| Desktop centrifuge | Hi-Tech Co. | ATT101 | swing rotor type |
| Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) | Nitoms | T4613 | |
| Glass vial | AS ONE | 6-306-01 | Durham fermentation tube |
| Glucose | Wako Pure Chemicals | 049-31165 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| Methanol | Wako Pure Chemicals | 133-16771 | |
| Microscopic heating stage system | TOKAI HIT | TP-110R-100 | |
| Mineral oil | Nacalai Tesque | 23334-85 | |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Objective lens | Olympus | LUCPLFLN 40×/0.6 NA | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids | 610005 | pore size 100 nm |
| sCMOS camera | Andor | Zyla 4.2 plus | |
| Sodium chloride | Wako Pure Chemicals | 191-01665 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemicals | 196-00015 | |
| Ultrasonic bath | AS ONE | ASU-3D | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212750 | |
| 0.6 mL lidded plastic tube | Watson | 130-806C | |
| 1.5 mL lidded plastic tube | Sumitomo Bakelite Co. | MS4265-M | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline | Avanti Polar Lipids | 850457P | POPC |
| 1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti Polar Lipids | 880129P | Biotin-PEG-DSPE |
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