Geração de hidrogéis com base em colágeno 3-D para analisar o crescimento e o comportamento axonal durante o desenvolvimento do sistema nervoso

Axônios neuronais, terminando em cones de crescimento axonal, migram longas distâncias através da matriz extracelular (ECM) do embrião sobre caminhos específicos para atingir seus alvos adequados. O cone de crescimento é a porção distal do AXON e é especializado para sentir o ambiente físico e molecular da célula^1,2. Do ponto de vista molecular, os cones de crescimento são guiados por pelo menos quatro mecanismos moleculares diferentes: atração de contato, quimioatração, repulsão de contato e chemorepulsion desencadeada por diferentes pistas de orientação axonal^{3,4 , 5. º , 6}. os processos mediados por contato podem ser parcialmente monitorados em culturas bidimensionais (2D) em substratos micropadronizados (por exemplo, com listras^7,8 ou manchas⁹ contendo as moléculas). No entanto, axônios podem navegar para o seu alvo de forma não-diffusiva, sentindo várias moléculas atraentes e repulsivas de células guidepost no ambiente^4,5,10. Aqui, nós descrevemos um método fácil da cultura 3-D para verific se uma molécula secretado induz efeitos chemorepulsive ou chemoattractive em axônios tornando-se.

Os primeiros estudos objetivaram determinar os efeitos das pistas de orientação AXON utilizadas culturas explantes em matrizes tridimensionais (3-D) para gerar gradientes simulando in vivo as condições^11,12. Essa abordagem, juntamente com experimentos in vivo, permitiu a identificação de quatro grandes famílias de pistas de orientação: netrins, fendas, semaphorinas e ephrins^4,5,6. Essas pistas moleculares e outros fatores¹³ são integrados pelos crescentes axônios, desencadeando a dinâmica dos complexos de adesão e as forças mecânicas transacionadoras através do citoesqueleto^14,15,16. Para gerar gradientes moleculares em culturas 3-D para navegação axonal, pesquisadores pioneiros usaram substratos de coágulo plasmático¹⁷, que também foi utilizado para preparações organotípicas de fatia¹⁸. No entanto, em 1958, foi relatado um novo protocolo para a geração de hidrogéis de colágeno 3-D para estudar com os dispositivos da Maximow¹⁹, uma plataforma de cultura, utilizada em vários estudos adequados para observações microscópicas²⁰. Outro estudo pioneiro relatou o gel de colágeno como uma ferramenta para incorporar fibroblastos humanos para estudar a diferenciação de fibroblastos em miofibroblastos em processos de cicatrização de feridas²¹. Paralelamente, Lumsden e Davies aplicaram colágeno da derme bovina para analisar o efeito putativo do fator de crescimento do nervo (NGF) na orientação das fibras nervosas sensoriais²². Com o desenvolvimento de novas plataformas de cultura (por exemplo, placas multipoços) por diferentes empresas e laboratórios, as culturas colágenas foram adaptadas a esses novos dispositivos^{6,23,24,25 ,26}. Paralelamente, um extrato de material de ECM derivado da linhagem de células tumorais de Engelbreth-Holm-Swarm foi disponibilizado comercialmente para ampliar esses estudos²⁷.

Recentemente, vários protocolos foram desenvolvidos para gerar gradientes moleculares com papéis putativos na orientação do AXON usando hidrogéis 3-D (por exemplo, colágeno, fibrina, etc.) ²⁸. Alternativamente, a molécula candidata pode ser imobilizada em diferentes concentrações em uma matriz porosa (por exemplo, NGF²⁹) ou gerada pela cultura em uma pequena região dos agregados de células hidrogel 3-D secretando a molécula para gerar um radial gradiente^{4,23,24,25,26}. A última possibilidade será explicada neste protocolo.

O procedimento apresentado aqui é um método fácil, rápido e altamente reprodutível baseado na análise do crescimento axonal em culturas 3-D do hidrogel do cérebro embrionário do rato. Em comparação com outros métodos, o protocolo é bem adequado para pesquisadores não treinados e pode ser totalmente desenvolvido após um treinamento curto (1-2 semanas). Neste protocolo, Nós isolamos primeiramente o colagénio das caudas adultas do rato para gerar mais matrizes 3-D em que os agregados genetically-modificados da pilha são cultivados na frente do tecido neuronal embrionário. Estes agregados de células formam gradientes químicos radiais de uma molécula candidata que provoca uma resposta para os axônios crescentes. Finalmente, a avaliação dos efeitos da molécula em axônios crescentes pode ser facilmente realizada usando uma microscopia de contraste de fase ou, alternativamente, métodos imunocitróxicos.