Génération d'hydrogels à base de collagène 3D pour analyser la croissance et le comportement axonal pendant le développement du système nerveux
Summary
Ici, nous fournissons une méthode pour analyser le comportement des axones en croissance dans les matrices 3D, imitant leur développement naturel.
Abstract
Ce protocole utilise du collagène naturel de type I pour générer de l’hydrogel tridimensionnel (3-D) pour la surveillance et l’analyse de la croissance axonale. Le protocole est centré sur la culture de petits morceaux de cerveaux embryonnaires ou postnatals de rongeurs à l’intérieur d’un hydrogel 3D formé par le collagène de type I dérivé du tendon de queue de rat avec la porosité spécifique. Les morceaux de tissu sont cultivés à l’intérieur de l’hydrogel et confrontés à des fragments de cerveau spécifiques ou des agrégats de cellules génétiquement modifiés pour produire et sécrére des molécules appropriées pour créer un gradient à l’intérieur de la matrice poreuse. Les étapes de ce protocole sont simples et reproductibles, mais comprennent des étapes critiques à examiner attentivement au cours de son développement. En outre, le comportement des axones croissants peut être surveillé et analysé directement à l’aide d’un microscope de contraste de phase ou d’un microscope à fluorescence mono/multiphoton après fixation par des méthodes immunocytochimiques.
Introduction
Les axones neuronaux, se terminant par des cônes de croissance axonale, migrent sur de longues distances à travers la matrice extracellulaire (ECM) de l’embryon sur des voies spécifiques pour atteindre leurs cibles appropriées. Le cône de croissance est la partie distale de l’axone et il est spécialisé pour détecter l’environnement physique et moléculaire de la cellule1,2. D’un point de vue moléculaire, les cônes de croissance sont guidés par au moins quatre mécanismes moléculaires différents : attraction de contact, chimioattraction, répulsion de contact, et chemorepulsion déclenchée par différents indices de guidage axonal3,4 , 5 Annonces , 6. Les processus négociés par contact peuvent être partiellement surveillés dans des cultures bidimensionnelles (2D) sur des substrats micro-modèles (p. ex., avec des rayures7,8 ou des taches9 contenant les molécules). Cependant, les axones peuvent naviguer vers leur cible d’une manière non-diffusive en sentant plusieurs molécules attrayantes et répulsives des cellules de guidage dans l’environnement4,5,10. Ici, nous décrivons une méthode facile de culture 3-D pour vérifier si une molécule sécrétée induit des effets chémorepulsifs ou chimioattractive sur le développement des axones.
Les premières études visaient à déterminer les effets des indices de guidage d’axone utilisés explant cultures dans des matrices tridimensionnelles (3-D) pour générer des gradients simulant des conditions in vivo11,12. Cette approche, ainsi que des expériences in vivo, a permis d’identifier quatre grandes familles de repères d’orientation: Netrins, Slits, Semaphorins, et Ephrins4,5,6. Ces indices moléculaires et d’autres facteurs13 sont intégrés par les axones en croissance, déclenchant la dynamique des complexes d’adhérence et transduisant les forces mécaniques via le cytosquelette14,15,16. Pour générer des gradients moléculaires dans les cultures 3D pour la navigation axonale, les chercheurs pionniers ont utilisé des substrats de caillots plasmatiques17, qui a également été utilisé pour les préparations de tranches organotypiques18. Cependant, en 1958, un nouveau protocole pour générer des hydrogels de collagène 3D a été rapporté pour l’étude avec les dispositifs de Maximow19, une plate-forme de culture, utilisée dans plusieurs études appropriées pour les observations microscopiques20. Une autre étude pionnière a rapporté le gel de collagène comme outil pour intégrer des fibroblastes humains pour étudier la différenciation des fibroblastes dans les myofibroblastes dans les processus de guérison des plaies21. En parallèle, Lumsden et Davies ont appliqué du collagène du derme bovin pour analyser l’effet putatif du facteur de croissance nerveuse (NGF) sur le guidage des fibres nerveuses sensorielles22. Avec le développement de nouvelles plateformes culturelles (p. ex., plaques multi-puits) par différentes entreprises et laboratoires, les cultures de collagène ont été adaptées à ces nouveaux dispositifs6,23,24,25 ,26. En parallèle, un extrait de matériel d’ECM dérivé de la lignée cellulaire de tumeur d’Engelbreth-Holm-Swarm a été rendu disponible commercialement pour étendre ces études27.
Récemment, plusieurs protocoles ont été développés pour générer des gradients moléculaires avec des rôles putatifs dans le guidage des axones à l’aide d’hydrogels 3D (p. ex. collagène, fibrine, etc.) 28. Alternativement, la molécule candidate peut être immobilisée à une concentration différente dans une matrice poreuse (p. ex., NGF29) ou générée par la culture dans une petite région des agrégats de cellules hydrogel 3D sécrétant la molécule pour générer un rayonnement gradient4,23,24,25,26. La dernière possibilité sera expliquée dans ce protocole.
La procédure présentée ici est une méthode facile, rapide et hautement reproductible basée sur l’analyse de la croissance axonale dans les cultures d’hydrogel 3D du cerveau embryonnaire de souris. En comparaison avec d’autres méthodes, le protocole est bien adapté aux chercheurs non formés et peut être entièrement développé après une courte formation (1-2 semaines). Dans ce protocole, nous isolons d’abord le collagène des queues de rat adultes pour produire davantage de matrices 3D dans lesquelles les agrégats de cellules génétiquement modifiés sont cultivés devant le tissu neuronal embryonnaire. Ces agrégats cellulaires forment des gradients chimiques radiaux d’une molécule candidate qui provoque une réponse pour les axones en croissance. Enfin, l’évaluation des effets de la molécule sur les axones en croissance peut facilement être effectuée à l’aide d’une microscopie de contraste de phase ou, alternativement, de méthodes immunocytochimiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
La croissance des axones en développement est principalement invasive et comprend la dégradation et le remodelage de l’ECM. En utilisant la procédure présentée ici, les chercheurs peuvent obtenir une matrice 3D homogène formée par le collagène naturel de type I dans lequel les axones (ou cellules) peuvent répondre à un gradient chimique sécrété par des cellules génétiquement modifiées comme ils le font in vivo. Différentes réponses axonales aux gradients de repères attrayants ou inhibiteurs (protéines…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Tom Yohannan pour les conseils éditoriaux et M. Segura-Feliu pour l’assistance technique. Ces travaux ont été financés par le programme CERCA et par la Commission des universités et de la recherche du Département de l’innovation, des universités et de l’entreprise de la Generalitat de Catalunya (SGR2017-648). Ces travaux ont été financés par le Ministère espagnol de la recherche, de l’innovation et de l’université (MEICO) par l’intermédiaire de BFU2015-67777-R et RTI2018-099773-B-100, le Réseau Prion espagnol (Prionet Espagne AGL2017-90665-REDT), et l’Institut Carlos III, CIBERNED ( PRY-2018-2).
Materials
| Material | |||
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB) | Sigma | D5905 | |
| Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) | Vector Labs | PK-4000 | |
| B27 serum-free supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| cDNA plasmid vectors | |||
| COS1 cell lines | ATTC | CRL-1570 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 16325 | |
| D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium | Sigma | G8769 | |
| D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium | Invitrogen | 41966-029 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2+) (D-PBS) for cultures | Invitrogen | 14200 | |
| Ethanol | merck | 108543 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 17984-25 | |
| Gelatin powder | Sigma | G1890 | |
| Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008) | Panreac | 211008 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 24020083 | |
| Heat-inactivated foetal bovine serum | Invitrogen | 10108-165 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water) | Sigma | 316989 | |
| L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium | Invitrogen | 25030-024 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Invitrogen | 11012-044 | |
| Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1) | Biolegend | 801201 | |
| N-2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 1,040,051,000 | |
| Penicillin/streptomycin solution 100x | Invitrogen | 15140-22 | |
| Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry | Invitrogen | AM9624 | |
| Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse | Vector Labs | BA-2000 | |
| Serum-free medium (Opti-MEM) | Invitrogen | 11058-021 | |
| Sodium azide | Panreac | 162712 | |
| Sodium bicarbonate solution 7.5% | Invitrogen | 25080-094 | |
| Sterile culture grade H2O | Sigma | W3500 | |
| TritonTM X-100 | Sigma | X100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Equipment | |||
| 1 large and 1 small curved scissors for dissection | Fine tools Instruments or similar | ||
| 1.5-ml conical centrifuge tubes | Eppendorf or similar | ||
| 15-ml conical centrifuge tubes | Corning or similar | ||
| 2 haemostats | Fine tools Instruments or similar | ||
| 2 small straight dissecting scissors | Fine tools Instruments or similar | ||
| 200-ml centrifuge tubes for centrifugation | Nalgene or similar | ||
| 200-ml sterile glass conical flasks | |||
| 2-litre glass beaker | |||
| 4- and 6-well culture plates | Nunc | 176740 and 140675 | |
| Automatic pipette pumps and disposable 10 ml and 25 ml filter-containing sterile plastic pipettes. | Gilson, Brand, Eppendorf or similar | ||
| Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips | Gilson, Eppendorf or similar | ||
| Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 ml tube adaptors) | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Cell culture incubator at 37 ºC, 5% CO2 and 95% air | |||
| Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma | D9402 | |
| Dialysis tubing closures | Sigma | Z37101-7 | |
| Disposable glass pipettes | |||
| Dissecting microscope with dark field optics | Olympus SZ51 or similar | ||
| High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor | |||
| Laminar flow hood | |||
| Large 100-mm, 60-mm and small 35-mm Ø cell culture dishes | Nunc | 150679 , 150288 and 150318, respectively | |
| Magnetic stirrer and magnetic spin bars | IKA or similar | ||
| McIlwain tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering | ||
| One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps | Fine tools Instruments or similar | ||
| Razor blades for the tissue chopper | |||
| Scalpels (number 15 and 11) | |||
| Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces | Fine tools Instruments or similar | ||
References
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