דור של 3-D הידרוג'לים קולגן מבוססי לנתח צמיחה Axonal התנהגות במהלך פיתוח מערכת העצבים
Summary
כאן, אנו מספקים שיטה לניתוח התנהגות של האקטונים הגדלים בתוך מטריצות תלת-ממד, מחקה את התפתחותם הטבעית.
Abstract
פרוטוקול זה משתמש טבעי סוג אני קולגן לייצר תלת מימדי (3-D) הידרוג’ל לניטור וניתוח של הצמיחה סיבי. הפרוטוקול ממורכז על פיסות קטנות של המוח העובריים או מוקדם לידלנטאל מכרסמים בתוך 3-D הידרוג’ל שנוצר על ידי גיד הזנב חולדה-נגזר סוג שאני קולגן עם מפרט ספציפי. חתיכות רקמה הם מתורבתים בתוך ההידרוג’ל והתעמת עם שברי מוח ספציפיים או מהונדסים גנטית אגרגטים לייצר ולהפריש מולקולות מתאים ליצירת מעבר הדרגתי בתוך המטריצה הנקבובי. השלבים של פרוטוקול זה הם פשוטים ומיותחים אך כוללים צעדים קריטיים שייחשבו בקפידה במהלך התפתחותו. יתר על כן, התנהגות של אקסונים גדל ניתן לפקח ולנתח ישירות באמצעות מיקרוסקופ שלב-ניגודיות או מונו/מיקרוסקופ רב-משתמשים במיקרוסקופ פלואורסצנטית לאחר קיבעון על ידי שיטות אימונוטוקוכימיקלים.
Introduction
האקסון העצבי, המסתיים אצטרובלים הצמיחה axons, להעביר מרחקים ארוכים דרך מטריצה החילוץ (ECM) של העובר על מסלולים ספציפיים כדי להגיע למטרות המתאימות שלהם. חרוט הצמיחה הוא החלק המרוחק של אקסון והוא מתמחה לחוש את הסביבה הפיזית והמולקולרית של התא1,2. מבחינה מולקולרית, אצטרובלים הצמיחה מונחים על-ידי לפחות ארבעה מנגנונים מולקולריים שונים: האטרקציה קשר, כימומשיכה, קשר דחייה, ו chemorepulsion מופעל על ידי רמזים שונים הדרכה סיבי3,4 , מיכל 5 , 6. ניתן לעקוב אחר תהליכים בתיווך באופן חלקי בתרבויות דו ממדיות (2d) על גבי מיקרו-מצעים (לדוגמה, עם פסים7,8 או כתמים9 המכילים את המולקולות). עם זאת, אקסונים יכולים לנווט אל היעד שלהם באופן לא מושפע על ידי חישת מספר מולקולות אטרקטיבי ודוחה מתוך הנחיה התאים בסביבה4,5,10. כאן, אנו מתארים שיטה קלה של תרבות תלת-ממדית כדי לבדוק אם המולקולה המופרש גורמת להשפעות של השפעות מושכות או כימוחלות על מפתח אקסונים.
המחקרים המוקדמים ביותר שנועדו לקבוע את ההשפעות של הרמזים אקסון הדרכה השתמשו בתרבויות המחקר תלת מימדי (3-D) מטריצות כדי ליצור מעברי צבע הדמיית בתנאים vivo11,12. גישה זו, יחד עם ניסויים vivo, מותר לזהות ארבע משפחות מרכזיות של רמזים ההנחיה: netrins, חריצים, סמבורנים, והאורגים4,5,6. אלה סימנים מולקולריים וגורמים אחרים13 משולבים על ידי axons גדל, מפעילה את הדינמיקה של מכלולי הדבקה והתמרה כוחות מכניים דרך שלד ציטומה14,15,16. כדי ליצור מעברי צבע מולקולריים בתרבויות תלת-ממד עבור ניווט סיבי, חוקרים חלוצי השתמשו קריש פלזמה מצעים17, אשר שימש גם עבור ההכנות פרוסה otypic18. עם זאת, בשנת 1958, פרוטוקול חדש להפקת הידרוג’ל קולגן תלת-ממדי דווח ללימוד עם מכשירים ́s מיאטו19, פלטפורמת תרבות, בשימוש במספר מחקרים המתאימים לתצפיות מיקרוסקופיים20. עוד מחקר חלוץ דיווחו על ג’ל קולגן ככלי להטביע את הגידולים האנושיים לחקר הבידול של פיברובמות לתוך מיופיברופיצוצים בתהליך ריפוי הפצע21. במקביל, Lumsden ו דיוויס להחיל קולגן מפני השור הפרה כדי לנתח את ההשפעה הפוטיבית של גורם הגדילה העצבי (NGF) על המנחה סיבי העצב החושי22. עם פיתוח פלטפורמות תרבות חדשות (g., צלחות מרובות) על ידי חברות ומעבדות שונות, תרביות קולגן הותאמו אלה מכשירים חדשים6,23,24,25 ,26. במקביל, תמצית של חומר ECM הנגזר מתוך קו הגידול של הולם-ההולם-נחיל של מהפך להיות זמין מסחרית כדי להרחיב את המחקרים27.
לאחרונה, מספר פרוטוקולים פותחו כדי ליצור מעברי צבע מולקולריים עם תפקידים בשיטת אקסון הדרכה באמצעות הידרוג תלת-ממדי (למשל, קולגן, פיברוב, וכו ‘) 28. לחילופין, מולקולת המועמד יכול להיות מנופף בריכוז שונה במטריצה נקבובי (g., ngf29) או שנוצר על ידי culturing באזור קטן של אגרגטים תלת-ממד תא הידרוג’ל הפרשת המולקולה כדי ליצור רדיאלי מעבר צבע4,23,24,25,26. האפשרות האחרונה תהיה מוסברת בפרוטוקול זה.
ההליך המוצג כאן הוא שיטה קלה, מהירה ומאוד מבחינה מעשית המבוססת על ניתוח של צמיחה סיבי בתרבויות תלת-ממד הידרוג’ל של מוח העכבר העובריים. בהשוואה לשיטות אחרות, הפרוטוקול מתאים היטב לחוקרים שאינם מאומנים וניתן לפיתוח מלא לאחר אימון קצר (1-2 שבועות). בפרוטוקול זה, אנחנו הראשון לבודד קולגן מזנבות עכברוש מבוגר כדי ליצור עוד מטריצות תלת-ממד שבו אגרגטים תאים מהונדסים גנטית הם מתורבתים מול רקמת עצבי עובריים. אלה אגרגטים תאים טופס מעברי צבע כימיים רדיאלי של מולקולה מועמד אשר מעורר את התגובה של axons גדל. לבסוף, ניתן לבצע בקלות את הערכת ההשפעות של המולקולה על האקטונים הגדלים באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה או, לחילופין, שיטות אימונוציטוטוקכימיקלים.
Protocol
Representative Results
Discussion
צמיחת האקסונים המתפתחים היא פולשנית בעיקר וכוללת השפלה ושיפוץ ECM. באמצעות ההליך המוצג כאן, החוקרים יכולים להשיג מטריקס תלת-ממד הומוגנית שנוצר על ידי סוג טבעי אני קולגן שבו אקסונים (או תאים) יכול להגיב מעבר הדרגתי כימי מופרש על ידי תאים גנטית שונה כפי שהם עושים ב vivo. תגובות סיבי שונות מעברי צ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לטום יוחנן על עצת המערכת ומסיה סגורה-פליקס לקבלת סיוע טכני. עבודה זו ממומנת על ידי תוכנית CERCA ועל ידי הנציבות עבור אוניברסיטאות ומחקר של המחלקה לחדשנות, אוניברסיטאות, וארגון של הגנרל לטאת דה קטלוניה (SGR2017-648). עבודה זו מומן על ידי משרד הספרדית של מחקר, חדשנות ואוניברסיטת (MEICO) דרך BFU2015-67777-R ו RTI2018-099773-B-100, הספרדי Prion הרשת (Prion ספרד AGL2017-90665-REDT), ואת המכון קרלוס השלישי, CIBERNED ( חטט-2018-2).
Materials
| Material | |||
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB) | Sigma | D5905 | |
| Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) | Vector Labs | PK-4000 | |
| B27 serum-free supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| cDNA plasmid vectors | |||
| COS1 cell lines | ATTC | CRL-1570 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 16325 | |
| D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium | Sigma | G8769 | |
| D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium | Invitrogen | 41966-029 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2+) (D-PBS) for cultures | Invitrogen | 14200 | |
| Ethanol | merck | 108543 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 17984-25 | |
| Gelatin powder | Sigma | G1890 | |
| Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008) | Panreac | 211008 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 24020083 | |
| Heat-inactivated foetal bovine serum | Invitrogen | 10108-165 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water) | Sigma | 316989 | |
| L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium | Invitrogen | 25030-024 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Invitrogen | 11012-044 | |
| Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1) | Biolegend | 801201 | |
| N-2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 1,040,051,000 | |
| Penicillin/streptomycin solution 100x | Invitrogen | 15140-22 | |
| Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry | Invitrogen | AM9624 | |
| Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse | Vector Labs | BA-2000 | |
| Serum-free medium (Opti-MEM) | Invitrogen | 11058-021 | |
| Sodium azide | Panreac | 162712 | |
| Sodium bicarbonate solution 7.5% | Invitrogen | 25080-094 | |
| Sterile culture grade H2O | Sigma | W3500 | |
| TritonTM X-100 | Sigma | X100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Equipment | |||
| 1 large and 1 small curved scissors for dissection | Fine tools Instruments or similar | ||
| 1.5-ml conical centrifuge tubes | Eppendorf or similar | ||
| 15-ml conical centrifuge tubes | Corning or similar | ||
| 2 haemostats | Fine tools Instruments or similar | ||
| 2 small straight dissecting scissors | Fine tools Instruments or similar | ||
| 200-ml centrifuge tubes for centrifugation | Nalgene or similar | ||
| 200-ml sterile glass conical flasks | |||
| 2-litre glass beaker | |||
| 4- and 6-well culture plates | Nunc | 176740 and 140675 | |
| Automatic pipette pumps and disposable 10 ml and 25 ml filter-containing sterile plastic pipettes. | Gilson, Brand, Eppendorf or similar | ||
| Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips | Gilson, Eppendorf or similar | ||
| Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 ml tube adaptors) | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Cell culture incubator at 37 ºC, 5% CO2 and 95% air | |||
| Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma | D9402 | |
| Dialysis tubing closures | Sigma | Z37101-7 | |
| Disposable glass pipettes | |||
| Dissecting microscope with dark field optics | Olympus SZ51 or similar | ||
| High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor | |||
| Laminar flow hood | |||
| Large 100-mm, 60-mm and small 35-mm Ø cell culture dishes | Nunc | 150679 , 150288 and 150318, respectively | |
| Magnetic stirrer and magnetic spin bars | IKA or similar | ||
| McIlwain tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering | ||
| One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps | Fine tools Instruments or similar | ||
| Razor blades for the tissue chopper | |||
| Scalpels (number 15 and 11) | |||
| Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces | Fine tools Instruments or similar | ||
References
- Ramón y Cajal, S. . Les nouvelles idées sur la structure du système nerveux chez l’homme et chez les vertébrés. , (1894).
- Ramón y Cajal, S. . Nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos. , (1893).
- Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834 (2010).
- Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. S. The molecular biology of axon guidance. Science. 274 (5290), 1123-1133 (1996).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (6), 001727 (2011).
- Rosentreter, S. M., et al. Response of retinal ganglion cell axons to striped linear gradients of repellent guidance molecules. Journal of Neurobiology. 37 (4), 541-562 (1998).
- Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nature Protocols. 2 (5), 1216-1224 (2007).
- von Philipsborn, A. C., et al. Growth cone navigation in substrate-bound ephrin gradients. Development. 133 (13), 2487-2495 (2006).
- Chen, H., He, Z., Tessier-Lavigne, M. Axon guidance mechanisms: semaphorins as simultaneous repellents and anti-repellents. Nature Neuroscience. 1 (6), 436-439 (1998).
- Jessell, T. M., Sanes, J. R. Development. The decade of the developing brain. Current Opinion in Neurobiology. 10 (5), 599-611 (2000).
- Serafini, T., et al. The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6. Cell. 78 (3), 409-424 (1994).
- Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2262 (2005).
- Fournier, M. F., Sauser, R., Ambrosi, D., Meister, J. J., Verkhovsky, A. B. Force transmission in migrating cells. Journal of Cell Biology. 188 (2), 287-297 (2010).
- Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40 (2), 209-227 (2003).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).
- Castellani, V. B. . Protocols for Neuronal Cell Culture. , (2001).
- Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).
- Billings-Gagliardi, S., Wolf, M. K. A simple method for examining organotypic CNS cultures with Nomarski optics. In Vitro. 13 (6), 371-377 (1977).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Science. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Earliest sensory nerve fibres are guided to peripheral targets by attractants other than nerve growth factor. Nature. 306 (5945), 786-788 (1983).
- Chedotal, A., et al. Semaphorins III and IV repel hippocampal axons via two distinct receptors. Development. 125 (21), 4313-4323 (1998).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Klein, R. Eph/ephrin signaling in morphogenesis, neural development and plasticity. Current Opinion in Cell Biology. 16 (5), 580-589 (2004).
- Wang, K. H., et al. Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching. Cell. 96 (6), 771-784 (1999).
- Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro. Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).
- Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP. Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).
- Kapur, T. A., Shoichet, M. S. Immobilized concentration gradients of nerve growth factor guide neurite outgrowth. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 68 (2), 235-243 (2004).
- Torres-Espin, A., Santos, D., Gonzalez-Perez, F., del Valle, J., Navarro, X. Neurite-J: an image-J plug-in for axonal growth analysis in organotypic cultures. Journal of Neuroscience Methods. 236, 26-39 (2014).
- Balestrini, J. L., et al. Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine. Biomaterials. 102, 220-230 (2016).
- Qian, J., et al. Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin. Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).
- Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).
- Garnotel, R., et al. Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95). Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).
- Montolio, M., et al. A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration. Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).
- Garcia-Gareta, E. Collagen gels and the ‘Bornstein legacy’: from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration. Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).
