神経系発達中の軸の成長と挙動を解析する3Dコラーゲンベースのヒドロゲルの生成

軸次成長コーンで終わる神経軸子は、適切な標的に到達するために、特定の経路上の胚の細胞外マトリックス(ECM)を通して長い距離を移動する。成長コーンは軸の遠位部分であり、細胞1、2の物理的および分子環境を感知することに特化している。分子の観点から、成長コーンは少なくとも4つの異なる分子メカニズムによって導かれる:接触引力、化学的魅力、接触反発、および異なる軸方向ガイダンスキュー3、4によって引き起こされる化学脈動^,5,6.接触媒介プロセスは、マイクロパターン基板上の2次元(2D)培養物(例えば、分子を含むストライプ7、8^またはスポット9)で部分的に監視することができる。しかし、軸ゴンは、環境4、5、10のガイドポスト細胞からいくつかの魅力的で反発性の分子を感知することによって、非拡散的な方法で標的にナビゲートすることができます。ここでは、分泌分子が軸子の発達に化学的または化学的な効果を誘導するかどうかを確認するための3-D培養の簡単な方法について説明する。

軸次誘導キューの効果を決定することを目的とした最も初期の研究は、生体内条件11,12でシミュレートする勾配を生成するために3次元(3-D)行列に植生培養物を使用した。このアプローチは、生体内実験と共に、ネトリン、スリット、セマフォリン、およびエフリン4、5、6の4つの主要な家族の同定を可能にした。これらの分子キューおよび他の^因子13は、成長する軸ソンによって統合され、接着複合体のダイナミクスを引き起こし、細胞骨格14、15、16を介して機械的力を伝達する。軸次ナビゲーションのための3D培養物中の分子勾配を生成するために、先駆的な研究者は、プラズマ血栓基^板17を使用し、これはまた、組織性スライス^製剤18に使用された。しかし、1958年に、3-Dコラーゲンヒドロゲルを生成する新しいプロトコルは、マキシモ・イズ・^{デバイス19、}培養プラットフォーム、顕微鏡観察20に適したいくつかの研究で使用される研究のために報告された。別の先駆的研究は、創傷治癒^{プロセス21}における筋線維芽細胞の分化を研究するためのヒト線維芽細胞を埋め込むためのツールとしてコラーゲンゲルを報告した。並行して、ラムズデンとデイヴィスはウシ真皮からコラーゲンを適用し、感覚神経線^維22の誘導に対する神経成長因子(NGF)のプテプティブ効果を解析した。異なる企業や研究室による新しい培養プラットフォーム(例えば、マルチウェルプレート)の開発に伴い、コラーゲン培養はこれらの新しいデバイス6、23、24、25に適応しました。 ^、26.並行して、エンゲルブレス-ホルム-スウォーム腫瘍細胞株に由来するECM材料の抽出物は、これらの^研究27を拡大するために市販された。

最近では、3Dヒドロゲル(例えば、コラーゲン、フィブリンなど)を用いた軸次ガイダンスにおいて、置き方の役割を有する分子勾配を生成するいくつかのプロトコルが開発されている。^28.あるいは、候補分子は、多孔質マトリックス中の異なる濃度(例えば、NGF29)で固定化するか、分子を分泌する3-Dヒドロゲル細胞凝集体の小さな領域で培養することによって生成され、放射状を生成することができる。グラデーション^{4,23,24,25,26}.最後の可能性は、このプロトコルで説明されます。

ここで提示される手順は、胚マウス脳の3-ヒドロゲル培養における軸生成長の分析に基づく、簡単で迅速かつ高い再現性の方法である。他の方法と比較して、プロトコルは、非訓練を受けた研究者に適しており、短いトレーニング(1-2週間)後に完全に開発することができます。このプロトコルでは、まず成ラットの尾からコラーゲンを分離し、遺伝子改変された細胞凝集体が胚性神経組織の前で培養される3Dマトリックスをさらに生成する。これらの細胞凝集体は、成長する軸子に対する応答を引き出す候補分子の放射状化学勾配を形成する。最後に、成長軸石に対する分子の効果の評価は、相コントラスト顕微鏡または、あるいは、あるいは、免疫細胞化学的方法を用いて容易に行うことができる。