Generation von 3-D-Kollagen-basierten Hydrogelen zur Analyse des axonalen Wachstums und Verhaltens während der Entwicklung des Nervensystems
Summary
Hier bieten wir eine Methode zur Analyse des Verhaltens wachsender Axone in 3D-Matrizen, die ihre natürliche Entwicklung imitieren.
Abstract
Dieses Protokoll verwendet natürliches Kollagen Typ I, um dreidimensionales (3-D) Hydrogel zur Überwachung und Analyse des axonalen Wachstums zu erzeugen. Das Protokoll konzentriert sich auf die Kultivierung kleiner Stücke embryonaler oder früher postnataler Nagetierhirne in einem 3-D-Hydrogel, das durch die von der Rattenschwanzsehne abgeleitete Art I Kollagen mit spezifischer Porosität gebildet wird. Gewebeteile werden im Hydrogel kultiviert und mit bestimmten Hirnfragmenten oder genetisch veränderten Zellaggregaten konfrontiert, um Moleküle zu erzeugen und abzusondern, die geeignet sind, einen Gradienten innerhalb der porösen Matrix zu erzeugen. Die Schritte dieses Protokolls sind einfach und reproduzierbar, enthalten jedoch kritische Schritte, die bei seiner Entwicklung sorgfältig zu berücksichtigen sind. Darüber hinaus kann das Verhalten wachsender Axone direkt mit einem Phasenkontrastmikroskop oder einem Mono-/Multiphotonenfluoreszenzmikroskop nach Fixierung mit immunzytochemischen Methoden überwacht und analysiert werden.
Introduction
Neuronale Axone, die in axonalen Wachstumskegeln enden, wandern große Entfernungen durch die extrazelluläre Matrix (ECM) des Embryos über bestimmte Pfade, um ihre entsprechenden Ziele zu erreichen. Der Wachstumskegel ist der distale Teil des Axons und es ist spezialisiert, die physikalische und molekulare Umgebung der Zelle1,2zu spüren. Aus molekularer Sicht werden Wachstumskegel durch mindestens vier verschiedene molekulare Mechanismen geleitet: Kontaktanziehung, Chemoattraktion, Kontaktabstoßung und Chemorepulsion, ausgelöst durch verschiedene axonale Leitlinien3,4 , 5 , 6. Berührungsvermittelte Prozesse können teilweise in zweidimensionalen (2D) Kulturen auf mikrogemusterten Substraten überwacht werden (z.B. mit Streifen7,8 oder Flecken9, die die Moleküle enthalten). Axone können jedoch auf nicht-diffusive Weise zu ihrem Ziel navigieren, indem sie mehrere attraktive und abstoßende Moleküle aus Leitpfostenzellen in der Umgebungerfassen 4,5,10. Hier beschreiben wir eine einfache Methode der 3D-Kultur, um zu überprüfen, ob ein abgesondertes Molekül chemorepulsive oder chemoattraktive Effekte auf die Entwicklung von Axonen induziert.
Die frühesten Studien zielten darauf ab, die Auswirkungen von Axon-Leitlinien zu bestimmen, die Explantkulturen in dreidimensionalen (3-D) Matrizen verwendeten, um Gradienten zu erzeugen, die in vivo Bedingungen11,12simulierten. Dieser Ansatz ermöglichte zusammen mit In-vivo-Experimenten die Identifizierung von vier Hauptfamilien von Beratungsstellen: Netrins, Slits, Semaphorins und Ephrins4,5,6. Diese molekularen Hinweise und andere Faktoren13 werden durch die wachsenden Axone integriert, die die Dynamik von Haftkomplexen auslösen und mechanische Kräfte über das Zytoskelett14,15,16transduzieren. Um molekulare Gradienten in 3D-Kulturen für die axonale Navigation zu erzeugen, verwendeten Pionierforscher Plasmagerinnselsubstrate17, die auch für organotypische Scheibenpräparate18verwendet wurden. 1958 wurde jedoch ein neues Protokoll zur Erzeugung von 3D-Kollagenhydrogelen für das Studium mit Maximows Geräten19berichtet, einer Kulturplattform, die in mehreren Studien verwendet wurde, die für mikroskopische Beobachtungen geeignetsind 20. Eine weitere Pionierstudie berichtete kollagengel als Werkzeug zur Einbettung menschlicher Fibroblasten zur Untersuchung der Differenzierung von Fibroblasten in Myofibroblasten in Wundheilungsprozessen21. Parallel dazu setzten Lumsden und Davies Kollagen aus der Rinderdermis ein, um die vermeintliche Wirkung des Nervenwachstumsfaktors (NGF) auf die leitenden Sensornervenfasern zu analysieren22. Mit der Entwicklung neuer Kulturplattformen (z.B. Multi-Well-Platten) durch verschiedene Firmen und Labore wurden Kollagenkulturen an diese neuen Geräte angepasst6,23,24,25 ,26. Parallel dazu wurde ein Extrakt aus ECM-Material aus der Engelbreth-Holm-Swarm-Tumorzelllinie kommerziell zur Verfügung gestellt, um diese Studien zu erweitern27.
Kürzlich wurden mehrere Protokolle entwickelt, um molekulare Gradienten mit vermeintlichen Rollen in der Axonführung mit 3-D-Hydrogelen (z. B. Kollagen, Fibrin usw.) zu erzeugen. 28. Alternativ kann das Kandidatenmolekül in unterschiedlicher Konzentration in einer porösen Matrix (z.B. NGF29) immobilisiert oder durch Kultivierung in einem kleinen Bereich der 3D-Hydrogelzellaggregate erzeugt werden, die das Molekül absondern, um eine radiale Gradient4,23,24,25,26. Die letzte Möglichkeit wird in diesem Protokoll erläutert.
Das hier vorgestellte Verfahren ist eine einfache, schnelle und hochreproduzierbare Methode, die auf der Analyse des axonalen Wachstums in 3-D-Hydrogelkulturen des embryonalen Maushirns basiert. Im Vergleich zu anderen Methoden eignet sich das Protokoll gut für nicht ausgebildete Forscher und kann nach einer kurzen Ausbildung (1-2 Wochen) voll entwickelt werden. In diesem Protokoll isolieren wir zunächst Kollagen aus erwachsenen Rattenschwänzen, um weitere 3D-Matrizen zu erzeugen, in denen genetisch veränderte Zellaggregate vor dem embryonalen neuronalen Gewebe kultiviert werden. Diese Zellaggregate bilden radiale chemische Gradienten eines Kandidatenmoleküls, was eine Reaktion auf die wachsenden Axone auslöst. Schließlich kann die Bewertung der Auswirkungen des Moleküls auf wachsende Axone leicht mit einer Phasenkontrastmikroskopie oder alternativ immunzytochemischen Methoden durchgeführt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Wachstum der Entwicklung von Axonen ist hauptsächlich invasiv und umfasst ECM-Abbau und Umbau. Mit dem hier vorgestellten Verfahren können die Forscher eine homogene 3D-Matrix erhalten, die durch das natürliche Kollagen Typ I gebildet wird, in dem Axone (oder Zellen) auf einen chemischen Gradienten reagieren können, der von genetisch veränderten Zellen abgesondert wird, wie sie es in vivo tun. Verschiedene axonale Reaktionen auf Gradienten attraktiver oder hemmender Cues (Protein, Lipide usw.) können leicht mit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Tom Yohannan für die redaktionelle Beratung und M. Segura-Feliu für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch das CERCA-Programm und die Kommission für Universitäten und Forschung der Abteilung innovation, Universitäten und Unternehmen der Generalitat de Catalunya (SGR2017-648) finanziert. Diese Arbeit wurde vom spanischen Ministerium für Forschung, Innovation und Universität (MEICO) über BFU2015-67777-R und RTI2018-099773-B-100, das spanische Prion-Netzwerk (Prionet Spain AGL2017-90665-REDT) und das Institut Carlos III, CIBERNED ( PRY-2018-2).
Materials
| Material | |||
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB) | Sigma | D5905 | |
| Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) | Vector Labs | PK-4000 | |
| B27 serum-free supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| cDNA plasmid vectors | |||
| COS1 cell lines | ATTC | CRL-1570 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 16325 | |
| D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium | Sigma | G8769 | |
| D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium | Invitrogen | 41966-029 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2+) (D-PBS) for cultures | Invitrogen | 14200 | |
| Ethanol | merck | 108543 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 17984-25 | |
| Gelatin powder | Sigma | G1890 | |
| Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008) | Panreac | 211008 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 24020083 | |
| Heat-inactivated foetal bovine serum | Invitrogen | 10108-165 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water) | Sigma | 316989 | |
| L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium | Invitrogen | 25030-024 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Invitrogen | 11012-044 | |
| Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1) | Biolegend | 801201 | |
| N-2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 1,040,051,000 | |
| Penicillin/streptomycin solution 100x | Invitrogen | 15140-22 | |
| Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry | Invitrogen | AM9624 | |
| Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse | Vector Labs | BA-2000 | |
| Serum-free medium (Opti-MEM) | Invitrogen | 11058-021 | |
| Sodium azide | Panreac | 162712 | |
| Sodium bicarbonate solution 7.5% | Invitrogen | 25080-094 | |
| Sterile culture grade H2O | Sigma | W3500 | |
| TritonTM X-100 | Sigma | X100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Equipment | |||
| 1 large and 1 small curved scissors for dissection | Fine tools Instruments or similar | ||
| 1.5-ml conical centrifuge tubes | Eppendorf or similar | ||
| 15-ml conical centrifuge tubes | Corning or similar | ||
| 2 haemostats | Fine tools Instruments or similar | ||
| 2 small straight dissecting scissors | Fine tools Instruments or similar | ||
| 200-ml centrifuge tubes for centrifugation | Nalgene or similar | ||
| 200-ml sterile glass conical flasks | |||
| 2-litre glass beaker | |||
| 4- and 6-well culture plates | Nunc | 176740 and 140675 | |
| Automatic pipette pumps and disposable 10 ml and 25 ml filter-containing sterile plastic pipettes. | Gilson, Brand, Eppendorf or similar | ||
| Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips | Gilson, Eppendorf or similar | ||
| Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 ml tube adaptors) | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Cell culture incubator at 37 ºC, 5% CO2 and 95% air | |||
| Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma | D9402 | |
| Dialysis tubing closures | Sigma | Z37101-7 | |
| Disposable glass pipettes | |||
| Dissecting microscope with dark field optics | Olympus SZ51 or similar | ||
| High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor | |||
| Laminar flow hood | |||
| Large 100-mm, 60-mm and small 35-mm Ø cell culture dishes | Nunc | 150679 , 150288 and 150318, respectively | |
| Magnetic stirrer and magnetic spin bars | IKA or similar | ||
| McIlwain tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering | ||
| One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps | Fine tools Instruments or similar | ||
| Razor blades for the tissue chopper | |||
| Scalpels (number 15 and 11) | |||
| Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces | Fine tools Instruments or similar | ||
References
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