توليد الجيل من 3D الكولاجين القائم على Hydrogels لتحليل النمو المحوري والسلوك أثناء تطوير الجهاز العصبي
Summary
هنا، نحن نقدم طريقة لتحليل سلوك نمو المحاور في المصفوفات ثلاثية الأبعاد، ومحاكاة نموها الطبيعي.
Abstract
يستخدم هذا البروتوكول الكولاجين الطبيعي من النوع الأول لتوليد هيدروجيل ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) لرصد وتحليل النمو المحوري. ويتركز البروتوكول على زراعة قطع صغيرة من أدمغة القوارض الجنينية أو المبكرة بعد الولادة داخل هيدروجيل ثلاثي الأبعاد يتكون من النوع المشتق من ذيل الجرذان I مع الكولاجين المسامية محددة. يتم استزراع قطع الأنسجة داخل هيدروجيل وتواجه شظايا الدماغ محددة أو مجاميع الخلايا المعدلة وراثيا لإنتاج وإفراز جزيئات مناسبة لخلق تدرج داخل المصفوفة المسامية. إن خطوات هذا البروتوكول بسيطة وقابلة للاستنساخ ولكنها تشمل خطوات حاسمة للنظر فيها بعناية أثناء وضعها. وعلاوة على ذلك، يمكن رصد سلوك المحاور المتنامية وتحليلها مباشرة باستخدام المجهر على النقيض من المرحلة أو المجهر الفلورسنت أحادية / متعددة الفوتونات بعد التثبيت عن طريق الأساليب المناعية.
Introduction
تهاجر المحاور العصبية، التي تنتهي بالمخاريط المحورية للنمو، لمسافات طويلة من خلال المصفوفة خارج الخلية (ECM) للجنين عبر مسارات محددة للوصول إلى أهدافها المناسبة. مخروط النمو هو الجزء البعيد من محور وهو متخصص في الشعور بالبيئة المادية والجزيئية للخلية1,2. من وجهة نظر جزيئية، يتم توجيه المخاريط النمو من قبل ما لا يقل عن أربع آليات جزيئية مختلفة: جذب الاتصال، الكيميائية، الاتصال النفور، وchemorepulsion الناجمة عن مختلف العظة توجيه محاور3،4 , 5 , 6. يمكن رصد العمليات التي يتم الاتصال بها بشكل جزئي في الثقافات ثنائية الأبعاد (2D) على ركائز صغيرة النقوش (على سبيل المثال، مع خطوط7أو8 أو بقع9 تحتوي على الجزيئات). ومع ذلك، يمكن للمحاور التنقل إلى هدفهم بطريقة غير انتشارية عن طريق الاستشعار عن بعدة جزيئات جذابة ومثيرة للاشمئزاز من خلايا الدليل في البيئة4،5،10. هنا، ونحن وصف طريقة سهلة للثقافة 3-D للتحقق مما إذا كان جزيء يفرز يحفز آثار chemorepulsive أو chemoattractive على تطوير المحاور.
وكانت الدراسات الأولى تهدف إلى تحديد آثار إشارات توجيه محور عصبي تستخدم ثقافات الزراعة في المصفوفات ثلاثية الأبعاد (3-D) لتوليد التدرجات محاكاة في ظروف الجسم الحي11،12. هذا النهج، جنبا إلى جنب مع التجارب في الجسم الحي، يسمح لتحديد الأسر الرئيسية الأربع من العظة التوجيهية: Netrins، Slits، سيمابورينس، وEphrins4،5،6. هذه العظة الجزيئية والعوامل الأخرى13 متكاملة من قبل المحاور المتنامية، مما أدى إلى ديناميات المجمعات الالتصاق والقوى الميكانيكية عبر الهيكل الخلوي14،15،16. لتوليد التدرجات الجزيئية في الثقافات ثلاثية الأبعاد للملاحة المحورية، استخدم الباحثون الرواد ركائز تجلط البلازما17،والتي كانت تستخدم أيضا لتحضيرات شريحة organotypic18. ومع ذلك، في عام 1958، تم الإبلاغ عن بروتوكول جديد لتوليد هيدروجيل الكولاجين 3-D لدراسة مع أجهزة ماكسيمو19،منصة الثقافة، وتستخدم في العديد من الدراسات المناسبة للملاحظات المجهرية20. وذكرت دراسة رائدة أخرى هلام الكولاجين كأداة لتضمين الخلايا الليفية البشرية لدراسة تمايز الخلايا الليفية في الخلايا العضلية الليفية في عمليات التئام الجروح21. بالتوازي، طبّق Lumsden وDavies الكولاجين من الأدمة البقري لتحليل التأثير المفترض لعامل نمو الأعصاب (NGF) على توجيه الألياف العصبية الحسية22. مع تطوير منصات ثقافية جديدة (على سبيل المثال، لوحات متعددة الآبار) من قبل شركات ومختبرات مختلفة، تم تكييف ثقافات الكولاجين لهذه الأجهزة الجديدة6،23،24،25 ،26. في موازاة ذلك، تم توفير خلاصة من مواد ECM المشتقة من خط خلايا الورم إنغلبريث-هولم-سرب تجارياً لتوسيع هذه الدراسات27.
وقد وضعت مؤخرا عدة بروتوكولات لتوليد التدرجات الجزيئية مع الأدوار المفترضة في توجيه محور عصبي باستخدام الهلام المائي ثلاثي الأبعاد (مثل الكولاجين، الفيبرين، الخ. 28. وكبديل عن ذلك، يمكن تجميد الجزيء المرشح بتركيز مختلف في مصفوفة مسامية (مثل NGF29)أو إنشاؤه عن طريق الزراعة في منطقة صغيرة من المجاميع خلية هيدروجيل ثلاثية الأبعاد تفرز الجزيء لتوليد شعاعي التدرج4,23,24,25,26. وسيجري شرح آخر إمكانية في هذا البروتوكول.
الإجراء المعروض هنا هو طريقة سهلة وسريعة وقابلة للاستنساخ للغاية استنادا إلى تحليل النمو المحوري في الثقافات هيدروجيل 3D من الدماغ الماوس الجنيني. بالمقارنة مع الطرق الأخرى، فإن البروتوكول مناسب تماما للباحثين غير المدربين ويمكن تطويره بالكامل بعد تدريب قصير (1-2 أسابيع). في هذا البروتوكول، نقوم أولاً بعزل الكولاجين عن ذيول الفئران البالغة لزيادة توليد المصفوفات ثلاثية الأبعاد التي يتم فيها زراعة مجاميع الخلايا المعدلة وراثياً أمام الأنسجة العصبية الجنينية. وتشكل هذه المجاميع الخلية تدرجات كيميائية شعاعية لجزيء مرشح مما يثير استجابة للمحاور المتنامية. وأخيرا، يمكن بسهولة تقييم آثار الجزيء على نمو المحاور باستخدام المجهر التباين المرحلة أو، بدلا من ذلك، أساليب Immunocytochemical.
Protocol
Representative Results
Discussion
نمو المحاور النامية هو في المقام الأول الغازية ويشمل تدهور ECM وإعادة عرض. باستخدام الإجراء المعروض هنا، يمكن للباحثين الحصول على مصفوفة ثلاثية الأبعاد متجانسة تتكون من الكولاجين الطبيعي I النوع الذي يمكن أن تستجيب فيه المحاور (أو الخلايا) لتدرج كيميائي يفرزه الخلايا المعدلة وراثياً كما ت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويشكر المؤلفان توم يوهانان على المشورة التحريرية وM. Segura-Feliu على المساعدة التقنية. تم تمويل هذا العمل من قبل برنامج المركز الإقليمي للبحوث والبحوث والبحوث من قبل لجنة الجامعات والبحوث التابعة لقسم الابتكار والجامعات والمؤسسة العامة لكاتالونيا (SGR2017-648). تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة البحوث والابتكار والجامعات الإسبانية (MEICO) من خلال BFU2015-67777-R وRTI2018-099773-B-100، وشبكة Prion الإسبانية (Prionet Spain AGL2017-90665-REDT)، ومعهد كارلوس الثالث، CIBERNED ( PRY-2018-2).
Materials
| Material | |||
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB) | Sigma | D5905 | |
| Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) | Vector Labs | PK-4000 | |
| B27 serum-free supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| cDNA plasmid vectors | |||
| COS1 cell lines | ATTC | CRL-1570 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 16325 | |
| D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium | Sigma | G8769 | |
| D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium | Invitrogen | 41966-029 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2+) (D-PBS) for cultures | Invitrogen | 14200 | |
| Ethanol | merck | 108543 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 17984-25 | |
| Gelatin powder | Sigma | G1890 | |
| Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008) | Panreac | 211008 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 24020083 | |
| Heat-inactivated foetal bovine serum | Invitrogen | 10108-165 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water) | Sigma | 316989 | |
| L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium | Invitrogen | 25030-024 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Invitrogen | 11012-044 | |
| Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1) | Biolegend | 801201 | |
| N-2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 1,040,051,000 | |
| Penicillin/streptomycin solution 100x | Invitrogen | 15140-22 | |
| Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry | Invitrogen | AM9624 | |
| Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse | Vector Labs | BA-2000 | |
| Serum-free medium (Opti-MEM) | Invitrogen | 11058-021 | |
| Sodium azide | Panreac | 162712 | |
| Sodium bicarbonate solution 7.5% | Invitrogen | 25080-094 | |
| Sterile culture grade H2O | Sigma | W3500 | |
| TritonTM X-100 | Sigma | X100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Equipment | |||
| 1 large and 1 small curved scissors for dissection | Fine tools Instruments or similar | ||
| 1.5-ml conical centrifuge tubes | Eppendorf or similar | ||
| 15-ml conical centrifuge tubes | Corning or similar | ||
| 2 haemostats | Fine tools Instruments or similar | ||
| 2 small straight dissecting scissors | Fine tools Instruments or similar | ||
| 200-ml centrifuge tubes for centrifugation | Nalgene or similar | ||
| 200-ml sterile glass conical flasks | |||
| 2-litre glass beaker | |||
| 4- and 6-well culture plates | Nunc | 176740 and 140675 | |
| Automatic pipette pumps and disposable 10 ml and 25 ml filter-containing sterile plastic pipettes. | Gilson, Brand, Eppendorf or similar | ||
| Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips | Gilson, Eppendorf or similar | ||
| Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 ml tube adaptors) | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Cell culture incubator at 37 ºC, 5% CO2 and 95% air | |||
| Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma | D9402 | |
| Dialysis tubing closures | Sigma | Z37101-7 | |
| Disposable glass pipettes | |||
| Dissecting microscope with dark field optics | Olympus SZ51 or similar | ||
| High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor | |||
| Laminar flow hood | |||
| Large 100-mm, 60-mm and small 35-mm Ø cell culture dishes | Nunc | 150679 , 150288 and 150318, respectively | |
| Magnetic stirrer and magnetic spin bars | IKA or similar | ||
| McIlwain tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering | ||
| One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps | Fine tools Instruments or similar | ||
| Razor blades for the tissue chopper | |||
| Scalpels (number 15 and 11) | |||
| Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces | Fine tools Instruments or similar | ||
References
- Ramón y Cajal, S. . Les nouvelles idées sur la structure du système nerveux chez l’homme et chez les vertébrés. , (1894).
- Ramón y Cajal, S. . Nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos. , (1893).
- Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834 (2010).
- Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. S. The molecular biology of axon guidance. Science. 274 (5290), 1123-1133 (1996).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (6), 001727 (2011).
- Rosentreter, S. M., et al. Response of retinal ganglion cell axons to striped linear gradients of repellent guidance molecules. Journal of Neurobiology. 37 (4), 541-562 (1998).
- Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nature Protocols. 2 (5), 1216-1224 (2007).
- von Philipsborn, A. C., et al. Growth cone navigation in substrate-bound ephrin gradients. Development. 133 (13), 2487-2495 (2006).
- Chen, H., He, Z., Tessier-Lavigne, M. Axon guidance mechanisms: semaphorins as simultaneous repellents and anti-repellents. Nature Neuroscience. 1 (6), 436-439 (1998).
- Jessell, T. M., Sanes, J. R. Development. The decade of the developing brain. Current Opinion in Neurobiology. 10 (5), 599-611 (2000).
- Serafini, T., et al. The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6. Cell. 78 (3), 409-424 (1994).
- Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2262 (2005).
- Fournier, M. F., Sauser, R., Ambrosi, D., Meister, J. J., Verkhovsky, A. B. Force transmission in migrating cells. Journal of Cell Biology. 188 (2), 287-297 (2010).
- Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40 (2), 209-227 (2003).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).
- Castellani, V. B. . Protocols for Neuronal Cell Culture. , (2001).
- Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).
- Billings-Gagliardi, S., Wolf, M. K. A simple method for examining organotypic CNS cultures with Nomarski optics. In Vitro. 13 (6), 371-377 (1977).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Science. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Earliest sensory nerve fibres are guided to peripheral targets by attractants other than nerve growth factor. Nature. 306 (5945), 786-788 (1983).
- Chedotal, A., et al. Semaphorins III and IV repel hippocampal axons via two distinct receptors. Development. 125 (21), 4313-4323 (1998).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Klein, R. Eph/ephrin signaling in morphogenesis, neural development and plasticity. Current Opinion in Cell Biology. 16 (5), 580-589 (2004).
- Wang, K. H., et al. Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching. Cell. 96 (6), 771-784 (1999).
- Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro. Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).
- Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP. Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).
- Kapur, T. A., Shoichet, M. S. Immobilized concentration gradients of nerve growth factor guide neurite outgrowth. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 68 (2), 235-243 (2004).
- Torres-Espin, A., Santos, D., Gonzalez-Perez, F., del Valle, J., Navarro, X. Neurite-J: an image-J plug-in for axonal growth analysis in organotypic cultures. Journal of Neuroscience Methods. 236, 26-39 (2014).
- Balestrini, J. L., et al. Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine. Biomaterials. 102, 220-230 (2016).
- Qian, J., et al. Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin. Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).
- Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).
- Garnotel, R., et al. Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95). Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).
- Montolio, M., et al. A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration. Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).
- Garcia-Gareta, E. Collagen gels and the ‘Bornstein legacy’: from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration. Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).
