Um modelo de camundongo não aleatório para reativação farmacológica de Mecp2 no cromossomo X inativo

O inativação do cromossoma de x (XCI) é um processo da compensação de dosagem que equilibra a expressão de gene x-lig silenciando uma cópia do cromossoma de x nas fêmeas¹. Como resultado, o cromossomo X inativo (XI) acumula características da heterocromatina incluindo metilação do DNA e alterações inibitórias da histona, como a histona H3-lisina 27 trimetilação (H3K27me3) e a histona H2A ubiquitinação (H2Aub) o regulador ². The mestre do silenciamento do cromossoma de x é a região do centro da x-inactivação (xic), ao redor 100-500 KB, que controla a contagem e o emparelhamento dos cromossomas de x, a escolha aleatória do cromossoma de x para a inactivação, e a iniciação e propagação do silenciamento ao longo do cromossomo X³. O processo de inactivação de X é iniciado pelo transcrito específico inativo de X (Xist) que reveste o XI em cis para mediar o silenciamento do cromossoma-largo e remodela a estrutura tridimensional do cromossoma de x⁴. Recentemente, diversas telas proteômica e genéticas identificaram reguladores adicionais de XCI, tais como proteínas interagindo do Xist ^5,6,^{7,8,9 , 10} de ^{, 11} anos de ^{, 12}. por exemplo, um estudo prévio usando uma tela de interferência de RNA em todo o genoma não tendencioso identificou 13 fatores de XCI Trans-acting (xcifs)¹². Mecanisticamente, XCIFs regulam a expressão Xist e, portanto, interferir com a função xcifs causa XCI defeituoso¹². Juntos, avanços recentes no campo forneceram insights importantes sobre a maquinaria molecular que é necessária para iniciar e manter o XCI.

A identificação de reguladores de XCI e a compreensão de seu mecanismo em XCI são diretamente relevantes às doenças humanas X-lig, tais como a síndrome de Rett (RTT)^13,14. RTT é uma desordem rara do neurodesenvolvimento causada por uma mutação heterozygous na proteína de ligação X-lig de methyl-CpG 2 (MeCP2) que afeta predominantly meninas¹⁵. Porque MeCP2 é ficada situada no cromossoma de X, as meninas de RTT são heterozygous para a deficiência de MeCP2 com as pilhas do ~ 50% que expressam o selvagem-tipo e o ~ 50% que expressam o mutante MeCP2. Notàvelmente, as pilhas do mutante de RTT abrigam uma cópia dormente mas selvagem-tipo de Mecp2 no XI, fornecendo uma fonte do gene funcional, que se reactivated, poderia potencial aliviar sintomas da doença. Além do que o RTT, há diversas outras doenças humanas lig X, para que o reativação de Xi representa uma aproximação terapêutica potencial, tal como a síndrome de DDX3X.

A inibição de XCIFs, A proteína quinase-1 dependente de 3-Fosfoinositídeo (PDPK1), e o tipo 1 do receptor do activina A (ACVR1), pelo RNA curto do hairpin (shRNA) ou pelos inibidores pequenos da molécula, reativam genes XI-lig¹². O reativação farmacológico de genes XI-lig é observado em vários modelos ex vivo que incluem linhas de pilha do fibroblasto do rato, neurônios corticais adultos do rato, fibroblasto embrionário do rato, e as linhas de pilha do fibroblasto derivadas de um paciente de RTT¹². Entretanto, se a reactivação farmacológica de genes XI-lig é viável in vivo permanece ser demonstrado. Um fator limitante é a falta de modelos animais eficazes para medir com precisão a expressão de genes de Xi reativado. Para este objetivo, um Xistδ: Mecp2/Xist: modelo do rato de Mecp2-GFP foi gerado que carreg um Mecp2 genetically etiquetado em XI em todas as pilhas devido ao apagamento heterozygous em Xist no cromossoma de X materno¹⁶. Usando este modelo, a expressão de Mecp2 de Xi foi quantificados depois do tratamento com nervos inibidores de xcifs no cérebro de ratos vivos. Aqui, a geração do modelo xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP mouse e metodologia para quantificar XI reativação em neurônios corticais usando ensaios baseados em imunofluorescência é descrita.