Pasif X kromozom üzerinde Mecp2 farmakolojik yeniden aktivasyonu için rasgele olmayan bir fare modeli
Summary
Burada, rastgele olmayan X kromozom inactivation ile uygulanabilir bir kadın duvar modeli oluşturmak için bir protokol tarif, yani, maternally miras X kromozom hücrelerde% 100 ‘ de aktif değildir. Ayrıca, pasif X kromozom in vivo farmakolojik reaktivasyonunun fizibilite, tolerabilite ve güvenliğini test etmek için bir protokol açıklanmaktadır.
Abstract
X kromozom inaktivasyonu (XCI) cinsiyeler arasında gen dozaj dengesi elde etmek için kadınlarda bir X kromozom rasgele susturulması olduğunu. Sonuç olarak, tüm kadınlar X bağlantılı gen ifadesi için heterozigot vardır. XCı ‘nın anahtar düzenleyicilerinin biri, XCı ‘nın başlatılması ve bakımı için gerekli olan Xist‘dir. Önceki çalışmalar, büyük ölçekli, fonksiyon kaybı genetik ekranı kullanarak 13 Trans hareket X kromozom inaktivasyon faktörünü (Xcıs) tespit etmiştir. ACVR1 ve PDPK1 gibi Xcıs ‘Ler, kısa saç pim RNA veya küçük molekül inhibitörleri kullanarak inhibisyonu, kültürlü hücrelerde X kromozom bağlantılı genleri yeniden etkinleştirir. Ancak Pasif X kromozom in vivo olarak yeniden aktive edilebilirliğinin fizibilite ve tolerabilitesi belirlenecek. Bu hedefe doğru, bir Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp fare modeli bir X kromozom üzerinde Xist silinmesi nedeniyle olmayan rasgele XCI ile üretilir. Bu modeli kullanarak, aktif X reaktivasyonu ölçüde XCıF inhibitörleri ile tedavi sonrasında fare beyin quantite oldu. Son zamanlarda yayımlanan sonuçları göstermek, ilk kez, Xcıfs farmakolojik inhibisyonu canlı fare beynin kortikal nöronlar içinde aktif X kromozom Mecp2 yeniden etkinleştirir.
Introduction
X kromozom inaktivasyonu (XCI) doz telafisi bir süreçtir x-bağlantılı gen ifadesi dişilerde x kromozom bir kopyasını susturarak dengeler1. Sonuç olarak, aktif olmayan X kromozom (Xi), histon H3-lizin 27 trimetilasyon (H3K27me3) ve histon H2A mayası (H2Aub) gibi DNA metilasyonu ve inhibitör histon modifikasyonları dahil heterokromatin karakteristik özelliklerini birikir 2. x kromozom susturulması Master regülatörü, x kromozomların sayım ve eşleştirme, inactivation için x kromozom rasgele seçimi ve başlama ve başlatma kontrolleri 100 − 500 KB civarında, xınactivation Merkezi (KIC) bölgedir X kromozom3boyunca susturma yayılması. X inaktivasyonu süreci, x kromozom4‘ ün üç boyutlu yapısını yeniden modellemek ve kromozom çapında susturulması için BDT ‘de bulunan XI ‘e özel transkript (xıst) tarafından başlatılır. Son zamanlarda, çeşitli proteomik ve genetik ekranlar XCI ek regülatörler tespit etti, gibi x-ist etkileşim proteinleri5,6,7,8,9 , 10 ‘ dan fazla , 11 ‘ i , 12. Örneğin, tarafsız genom çapında RNA parazit ekranı kullanan bir önceki çalışmada 13 Trans-hareket XCI faktörü (xcıs)12tespit edilmiştir. Mekanik olarak, Xcıs Xıst ifadesini düzenler ve bu nedenle xcıfs işlevine müdahale etmek arızalı XCI12‘ ye neden olur. Birlikte, alanda son gelişmeler XCı başlatmak ve korumak için gerekli olan moleküler makine içine önemli Öngörüler sağladı.
XCI regülatörlerinin tanımlanması ve XCI ‘daki mekanizmalarını anlamak Rett sendromu (RTT)13,14gibi X bağlantılı insan hastalıkları ile doğrudan ilgilidir. RTT, X-bağlantılı metil-CPG bağlayıcı protein 2 ‘ de bir heterozigot mutasyon nedeniyle nadir görülen bir nörogelişimsel hastalıktır (MECP2), ağırlıklı olarak kızları etkileyen15. MECP2 X kromozom üzerinde yer aldığından, RTT kızlar MECP2 eksikliği için heterozigot vardır ~ 50% vahşi tipi ifade hücreleri ve ~ 50% mutant MECP2ifade. Özellikle, RTT mutant hücreler bir uyuyan ama Wild-türü kopyası Mecp2 XI, fonksiyonel geni bir kaynak sağlayarak, hangi reaktive, potansiyel olarak hastalığın belirtileri hafifletmek olabilir. RTT ek olarak, Xi ‘nin yeniden aktivasyonu DDX3X sendromu gibi potansiyel bir terapötik yaklaşımın temsil ettiği diğer birçok X bağlantılı insan hastalıkları vardır.
Xcıfs inhibisyonu, 3-fosfoinositide bağımlı protein kinaz-1 (PDPK1), ve aktivin bir reseptör tipi 1 (ACVR1), kısa saç iğnesi RNA (shrna) veya küçük molekül inhibitörleri tarafından, XI bağlı genler reaktive12. XI bağlantılı genlerin farmakolojik reaktivasyonu, fare fibroblast hücre hatları, Yetişkin fare kortikal nöronlar, fare embriyonik fibroblastlar ve bir RTT hastadan elde edilen fibroblast hücre hatları içeren çeşitli ex vivo modellerde görülür12. Ancak, XI bağlantılı genlerin farmakolojik yeniden aktivasyonuna uygun olup olmadığını gösterilecektir. Bir sınırlama faktörü doğru yeniden XI genlerin ifade ölçmek için etkili hayvan modellerinin eksikliği. Bu hedefe doğru, bir xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp fare modeli, maternal X kromozom16üzerinde Xist heterozigot silme nedeniyle tüm hücreler XI üzerinde bir genetik etiketli Mecp2 taşır üretilir. Bu modeli kullanarak, XI Mecp2 ifadesi, canlı farelerin beyinde Xcıfs inhibitörleri ile tedavi sonrasında quantitite edilmiştir. Burada, Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp fare modeli ve metodolojisi nımofluorescence tabanlı asder kullanarak kortikal nöronlar üzerinde Niceye reaktivasyonu ile tanımlanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Daha önce, memeliler kadın hücrelerinde XI bağlantılı genlerin susturulması için seçici olarak gerekli olan Xcıs12tespit edildi. Biz daha fazla güçlü küçük molekül inhibitörleri hedef xcıgs, ACVR1 ve PDPK1, hangi verimli Xi-bağlantılı Mecp2 fare fibroblast hücre hatları, fare kortikal nöronlar ve insan fibroblast hücre yeniden akış efektörlere gibi optimize bir RTT hasta türetilmiştir. Bu sonuçlar, XI reaktivasyonunun X bağlantılı hastalık hastalarında…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, reaktifler sağlamak için Antonio Bedalov teşekkür ederiz; Virginia Üniversitesi doku histolojisi çekirdek kriyobölümleme için; Akış sitometri analizi için Virginia Üniversitesi akış sitometri çekirdeği; Christian Blue ve Saloni Singh, genotyping ile teknik yardım için. Bu çalışma Z.Z. için bir Double Hoo araştırma Grant ve Virginia-Virginia teknoloji tohum fonu Ödülü ve Hartwell Vakfı bireysel Biyomedikal Araştırma Ödülü Üniversitesi ‘nden bir pilot proje programı Ödülü tarafından destekleniyordu SB
Materials
| MICE | |||
| Mecp2tm3.1Bird | The Jackson Laboratory | #014610 | |
| B6;129-Xist (tm5Sado) | provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle | ||
| REAGENTS | |||
| 22×22 mm coverslip | FISHERfinest (Fisher Scientific) | 125488 | |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| 50 ml syringe | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
| 60mm culture dish | CellStar | 628160 | |
| 7-AAD | BioLegend | 420403 | |
| ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Chemical | A661-3 | |
| anti-GFP-AlexaFluor647 | Invitrogen | A-31852 | |
| anti-MAP2 | Aves Labs | MAP | |
| BSA | Promega | R396D | |
| Buprenorphine SR | Zoopharm | ||
| citric acid | Sigma | C-1857 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| fetal bovine serum (FBS) | VWR Life Science | 89510-198 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| glass slides | Fisherbrand | 22-034-486 | |
| goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody | Aves Labs | F-1005 | |
| GSK650394 | ApexBio | B1051 | |
| hamilton 10μl syringe | Hamilton Sigma-Aldrich | 28615-U | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-092 | |
| Ketamine | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | |
| Large blunt/blunt curved scissors | Fine Science Tools | 14519-14 | |
| LDN193189 | Cayman Chemicals | 11802 | |
| lodixanol | Sigma | 1343517 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Chemical | M35-212 | |
| Methylcelulose | Sigma | M0262-100G | |
| mounting medium with DAPI | Vectashield | H-1200 | |
| Needle tip, 26 GA x 1.25" | PrecisionGlide | 305111 | |
| ophthalmic ointment | Refresh Lacri-Lube | 93468 | |
| optimal cutting temperature (O.C.T.) | ThermoFisher | ||
| PCR mix | |||
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS) | Corning Cellgro | 46-103-CM | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P330-500 | |
| scalpel blades | |||
| Shallow glass or plastic tray | |||
| skin glue/tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| sodium azide | Fisher Scientific | CAS 26628-22-8 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S642-212 | |
| standard hemostat forceps | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Straight iris scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Tris-base | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| Xylazine | Akorn | NDC: 59399-111-50 | |
| EQUIPMENT | |||
| Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope | Zeiss | Zeiss AxioObserver | |
| 0.45mm burr | IDEAL MicroDrill | 67-1000 | |
| BD FACScalibur | |||
| centrifuge | |||
| glass homogenizer | |||
| cell culture incubator | Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i | 13-998-213 | |
| Leica 3050S research cryostat | |||
| stereotactic platform | |||
| thermocycler | |||
| Timer | |||
| ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima L-100 XP | ||
| Water bath (37 ºC) | Fisher Scientific Isotemp 2239 |
References
- Lyon, M. F. X-chromosome inactivation as a system of gene dosage compensation to regulate gene expression. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 36, 119-130 (1989).
- Heard, E. Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome. Current Opinion in Genetics Development. 15 (5), 482-489 (2005).
- Augui, S., Nora, E. P., Heard, E. Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre. Nature Review Genetics. 12 (6), 429-442 (2011).
- Pontier, D. B., Gribnau, J. Xist regulation and function explored. Human Genetics. 130 (2), 223-236 (2011).
- Barnes, C., Kanhere, A. Identification of RNA-Protein Interactions Through In Vitro RNA Pull-Down Assays. Methods in Molecular Biology. 1480, 99-113 (2016).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349 (6245), (2015).
- Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation. Current Biology. 26 (8), R338-R342 (2016).
- Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation. Curren Biology. 26 (10), 1383 (2016).
- Ridings-Figueroa, R., et al. The nuclear matrix protein CIZ1 facilitates localization of Xist RNA to the inactive X-chromosome territory. Genes and Development. 31 (9), 876-888 (2017).
- Sunwoo, H., Colognori, D., Froberg, J. E., Jeon, Y., Lee, J. T. Repeat E anchors Xist RNA to the inactive X chromosomal compartment through CDKN1A-interacting protein (CIZ1). Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. , (2017).
- Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12591-12598 (2014).
- Zoghbi, H. Y., Percy, A. K., Schultz, R. J., Fill, C. Patterns of X chromosome inactivation in the Rett syndrome. Brain Development. 12 (1), 131-135 (1990).
- Anvret, M., Wahlstrom, J. Rett syndrome: random X chromosome inactivation. Clinical Genetics. 45 (5), 274-275 (1994).
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nature Genetics. 23 (2), 185-188 (1999).
- Przanowski, P., et al. Pharmacological reactivation of inactive X-linked Mecp2 in cerebral cortical neurons of living mice. Proceedings of Natlional Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7991-7996 (2018).
- Borensztein, M., et al. Xist-dependent imprinted X inactivation and the early developmental consequences of its failure. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (3), 226-233 (2017).
- Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
- Cseke, L. J., Talley, S. M. A PCR-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of Imperata cylindrica. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
