Un modello di mouse non casuale per la riattivazione farmacologica di MECP2 sul cromosoma X inattivo

L’inattivazione cromosoma x (XCI) è un processo di compensazione del dosaggio che bilancia l’espressione genica legata all’X silenziando una copia del cromosoma X nelle femmine¹. Di conseguenza, il cromosoma X inattivo (XI) accumula le caratteristiche tipiche dell’eterocromatina, inclusa la metilazione del DNA e le modifiche dell’istone inibitorio, come l’istone H3-lisina 27 trimetilazione (H3K27me3) e l’istone H2A ubiquitinazione (H2Aub) ². il regolatore principale del silenziamento cromosomico x è la regione del centro di inattivazione x (XIC), intorno a 100 − 500 KB, che controlla il conteggio e l’accoppiamento dei cromosomi x, la scelta casuale del cromosoma x per l’inattivazione, e l’inizio e la diffusione del silenziamento lungo il cromosoma X³. Il processo di inattivazione X è iniziato dalla trascrizione specifica X inattiva (XIST) che ricopre il XI in CIS per mediare il silenziamento a livello cromosoma e rimodellare la struttura tridimensionale del cromosoma x⁴. Recentemente, diversi schermi proteomici e genetici hanno identificato ulteriori regolatori di XCI, come le proteine interagenti XIST ^{5,6,7,8,9 , 10} il ^{, 11} il ^{, 12}. ad esempio, uno studio precedente che utilizza uno schermo di interferenza dell’RNA a livello di genoma imparziale ha identificato 13 fattori XCI transagionanti (xcif)¹². Meccanisticamente, XCIFs regolano l’espressione XIST e quindi, interferendo con la funzione xcifs provoca XCI¹²difettoso. Insieme, i recenti progressi nel campo hanno fornito importanti approfondimenti sui macchinari molecolari che sono necessari per avviare e mantenere XCI.

L’identificazione dei regolatori XCI e la comprensione del loro meccanismo in XCI è direttamente rilevante per le malattie dell’uomo legate all’X, come la sindrome di Rett (RTT)^13,14. La RTT è un raro disturbo dello sviluppo neurologico causato da una mutazione eterozigote nella proteina 2 (MECP2) legata al metil-CPG X-linked che colpisce prevalentemente le ragazze¹⁵. Poiché MECP2 si trova sul cromosoma X, le ragazze RTT sono eterozigoti per deficit di MECP2 con ~ 50% cellule che esprimono Wild-Type e ~ 50% esprimendo MECP2mutante. In particolare, le cellule mutanti RTT porto una copia dormiente ma Wild-Type di MECP2 sul XI, fornendo una fonte del gene funzionale, che se riattivato, potrebbe potenzialmente alleviare i sintomi della malattia. Oltre alla RTT, ci sono diverse altre malattie umane legate alla X, per le quali la riattivazione di XI rappresenta un potenziale approccio terapeutico, come la sindrome DDX3X.

L’inibizione di XCIFs, 3-fosfoinositide dipendente proteina chinasi-1 (PDPK1), e activina un recettore di tipo 1 (ACVR1), sia da RNA corto (shRNA) o piccoli inibitori di molecola, riattiva geni XI-Linked¹². La riattivazione farmacologica dei geni collegati a XI è osservata in vari modelli ex vivo che includono linee cellulari di fibroblasti del topo, neuroni corticali di topi adulti, fibromi embrionali del topo e linee cellulari di fibroblast derivate da un paziente RTT¹². Tuttavia, se la riattivazione farmacologica dei geni collegati a XI è fattibile in vivo rimane da dimostrare. Un fattore limitante è la mancanza di modelli animali efficaci per misurare accuratamente l’espressione dei geni da riattivato XI. Verso questo obiettivo, è stato generato un modello di mouse Xistδ: MECP2/XIST: MECP2-GFP che trasporta un MECP2 geneticamente etichettato su XI in tutte le cellule a causa dell’eliminazione eterozigote in XIST sul cromosoma X materno¹⁶. Utilizzando questo modello, l’espressione di MECP2 da XI è stata quantitata dopo il trattamento con inibitori di XCIFs nel cervello dei topi viventi. Qui è descritta la generazione del modello di mouse Xistδ: MECP2/XIST: MECP2-GFP e la metodologia per quantificare la riattivazione di XI nei neuroni corticali utilizzando saggi basati su immunofluorescenza.