Ein nicht zufälliges Mausmodell zur pharmakologischen Reaktivierung von Mecp2 auf dem inaktiven X-Chromosom

X-Chromosomen-Inaktivierung (XCI) ist ein Prozess der Dosierkompensation, der X-verknüpfte Genexpression ausgleicht, indem eine Kopie des X-Chromosoms bei Frauen¹zum Schweigen gebracht wird. Das inaktive X-Chromosom (Xi) sammelt daher charakteristische Merkmale von Heterochromatin, darunter die DNA-Methylierung und hemmende Histonmodifikationen, wie die Histon-H3-Lysin 27-Trimethylation (H3K27me3) und die Histon-H2A-Ubiquitation (H2A) ². Der Hauptregler des X-Chromosomenschliakings ist die X-Inaktivierungs-Region (Xic), etwa 100 − 500 kb, die das Zählen und Paarung der X-Chromosomen, die zufällige Wahl des X-Chromosoms für die Inaktivierung und die Initiation und Ausbreitung von Schweigen entlang des X-Chromosoms 3. Der Prozess der X-Inaktivierung wird durch X-inaktive spezifische Transkription (Xist) eingeleitet, die den Xi in cis beschichtet, um Chromosomen-Sichern zu vermitteln und die dreidimensionale Struktur des X-Chromosoms4 neu zu modellieren. In jüngster Zeit haben mehrere proteomische und genetische Bildschirme zusätzliche Regulatoren von XCI identifiziert, wie zum Beispiel Xist interagierende Proteine 5^{,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12}. Zum Beispiel hat eine frühere Studie mit einem unvoreingenommenen genom-weiten RNA-Interferenzbildschirm 13 Trans-wirkende XCI-Faktoren(XCIFs) 12 identifiziert. Mechanisch regulieren XCIFs den Xist-Ausdruck und führen daher zu defekten XCI¹², die die XCIFs-Funktion stören. Zusammen haben die jüngsten Fortschritte auf diesem Gebiet wichtige Einblicke in die molekularen Maschinen gegeben, die für die Initiierung und Aufrechterhaltung von XCI erforderlich sind.

Die Identifizierung der XCI-Regulatoren und das Verständnis ihres Mechanismus in XCI sind für X-gebundene menschliche Krankheiten wie das Rett-Syndrom (RTT^{) 13,14}direkt relevant. RTT ist eine seltene Neuroentwicklungsstörung, die durch eine heterozygöse Mutation im X-verknüpften Methyl-CpG-Bindungsprotein 2 (MECP2) verursacht wird, das vorwiegend Mädchen 15 betrifft. Da sich MECP2 auf dem X-Chromosom befindet, sind RTT-Mädchen heterozygös für MECP2 -Mangel mit ~ 50% Zellen, die Wild-Typ und ~ 50% Ausdruck der Mutant MECP2ausdrücken. Vor allem die RTT-Mutantzellen beherbergen eine ruhende, aber wilde Kopie von Mecp2 auf dem Xi, die eine Quelle des funktionellen Gens darstellt, das, wenn es reaktiviert wird, möglicherweise Symptome der Krankheit lindern könnte. Neben RTT gibt es noch einige andere X-gebundene menschliche Krankheiten, für die die Reaktivierung von Xi einen möglichen therapeutischen Ansatz darstellt, wie das DDX3X-Syndrom.

Hemmung von XCIFs, 3-phosphoinositid-abhängigem Protein Kinase-1 (PDPK1) und Aktivierung von A-Rezeptor Typ 1 (ACVR1), entweder durch kurze Haarnadel-RNA (shRNA) oder kleine Molekül-Inhibitoren, reaktiviert Xi-verknüpfte 12. Die pharmakologische Reaktivierung von Xi-verknüpften Genen wird in verschiedenen Ex-vivo-Modellen beobachtet, die Maus-Fischblätter-Linien, erwachsene Maus-kortikale Neuronen, Mäuse-Embryonalfibroblasten und Fibroblast-Zelllinien, die von einem RTT-Patienten¹²abgeleitet werden, umfassen. Ob in vivo eine pharmakologische Reaktivierung von Xi-gebundenen Genen möglich ist, bleibt jedoch abzuwarten. Ein begrenzender Faktor ist das Fehlen wirksamer Tiermodelle, um die Expression von Genen aus reaktivierten Xi genau zu messen. Zu diesem Ziel wurde ein Xist-: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp-Maus-Modell erstellt, das in allen Zellen ein genetisch beschriftetes Mecp2 auf Xi in allen Zellen trägt, da es im Xist auf dem mütterlichen X-Chromosom 16 eine heterozygöse Löschung gibt. Mit diesem Modell wurde der Ausdruck von Mecp2 von Xi nach der Behandlung mit XCIFs-Inhibitoren im Gehirn lebender Mäuse quantitativ behandelt. Hier wird die Generation der Xist-: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp-Maus-Modell und-Methodik zur Quantisierung der Xi-Recaktivierung in kortikalen Neuronen mit immunluoreszenalen Assays beschrieben.