דור של תא צורב עור תלת-ממד של כבל דם-derived המושרה בתאי גזע Pluripotent
Summary
אנו מציעים פרוטוקול זה מראה כיצד להבדיל keratinocytes נגזר תאי גזע pluripotent המושרה ו fibroblasts וליצור תא צורב של העור תלת-ממד באמצעות אלה keratinocytes ו fibroblasts. פרוטוקול זה מכיל צעד נוסף של יצירת מודל humanized עכברים. הטכניקה המובאת כאן תשפר את המחקר דרמטולוגית.
Abstract
העור הוא האיבר הגדול ביותר בגוף, יש פונקציות רבות. העור משמש מחסום פיסי, מגן על הגוף, מווסת את התפקודים הגופניים. ביומימטיקה היא החיקוי של דגמים, מערכות ורכיבים של הטבע לצורך פתרון בעיות אנושיות מורכבות1. ביומימטיקה העור הוא כלי שימושי עבור רפואה רגנרטיבית ויוו ומחקר במחלה במבחנה. תאי גזע pluripotent המושרה אנושי (iPSCs) יש על מאפייני התפשטות ללא הגבלה את היכולת של בידול שלוש שכבות הנבט. IPSCs האנושי נוצרים מתאי ראשי שונים, כגון תאי דם, keratinocytes, fibroblasts ועוד. ביניהם, כבל תאי תאי דם (CBMCs) הופיעו כמקור חלופי תא מנקודת המבט של רפואה רגנרטיבית allogeneic. CBMCs הם שימושי רפואה רגנרטיבית כי הקלדת אנטיגן (הלע) לויקוציטים אנושיים חיוני לתא מערכת בנקאות. אנו מספקים שיטה את הבידול של CBMC-iPSCs לתוך keratinocytes ו fibroblasts ועל הדור של תא צורב העור תלת-ממד. Keratinocytes CBMC iPSC-נגזר fibroblasts יש מאפיינים דומים לקו התא הראשי. Organoids העור תלת-ממד נוצרות על-ידי השלכת של שיכבת אל שכבת הדרמיס. מאת משתילים תא צורב את העור תלת-ממד, נוצר מודל humanized עכברים. מחקר זה מראה כי תא צורב תלת-ממד עור האדם הנגזרות iPSC עשוי להיות כלי הרומן חלופי למחקר דרמטולוגית במבחנה, ויוו.
Introduction
העור המכסה את פני השטח החיצוני של הגוף ומגנה על האיברים הפנימיים. לעור יש פונקציות שונות, כולל הגנה מפני פתוגנים, קליטת ואחסון מים, לווסת את טמפרטורת הגוף, הגוף מפריש לבזבז2. שתלי העור יכולים להיות מסווגים בהתאם לסוג מקור העור; שתלי באמצעות העור עוד תורם מכונים allografts, שתלי העור של המטופל באמצעות autografts. למרות בשתל הטיפול המועדפת עקב סיכון נמוך הדחייה שלה, ביופסיות עור קשים לביצוע על חולים עם פצעים חמורים או מספר לא מספיק של תאי העור. בחולים עם כוויות חמורות, שלוש פעמים את מספר תאי העור נחוצים לכסות שטחים גדולים. המוגבל של תאי עור מגופו של החולה תוצאות במצבים איפה השתלת allogenous הכרחי. יודע משמש באופן זמני עד עצמיים השתלת יכול להתבצע מאז היא בדרך כלל נדחית על ידי המערכת החיסונית של המחשב המארח לאחר כ שבוע 13. כדי להתגבר על דחייה על ידי המערכת החיסונית של החולה, שתלי חייב לבוא ממקור עם זהות המערכת החיסונית אותו כמו החולה4.
IPSCs האנושי הם מקור המתעוררים של תאים עבור טיפול בתאי גזע5. IPSCs האנושי נוצרים תאים סומטיים, באמצעות גורמים התיכנות כגון OCT4, SOX2, Klf4 ו- c-Myc6. שימוש iPSCs האדם מתגבר על בעיות אתיות ו של תאי גזע עובריים (ESCs)7,8. IPSCs האנושי יש pluripotency, יכולים להתמיין שלוש שכבות הנבט9. הנוכחות של הלע, גורם קריטי רפואה רגנרטיבית, קובע את התגובה החיסונית ועל האפשרות של דחיית10. השימוש של החולה, נגזר iPSCs פותר הבעיות של התא-מקור דחייה הגבלה ואת המערכת החיסונית. CBMCs הופיעו גם כמקור תא חלופי עבור רפואה רגנרטיבית11. הלע חובה להקליד, אשר מתרחש במהלך CBMC בנקאות, יכול לשמש בקלות עבור מחקר והשתלות. IPSCs הלע-סוג נוסף, homozygous נרחב ניתן להחיל על מטופלים שונים12. בנק CBMC-iPSC הוא רומן, אסטרטגיה יעילה עבור טיפול בתאי ו רפואה רגנרטיבית allogenic12,13,14. במחקר זה, אנו משתמשים CBMC-iPSCs, הבדיל keratinocytes ו fibroblasts, וצור שכבות העור 3D מרובדת. תוצאות של מחקר זה מציע כי תא צורב CBMC iPSC-נגזר עור תלת-ממד הוא כלי הרומן למחקר דרמטולוגית במבחנה, ויוו.
Protocol
Representative Results
Discussion
IPSCs האנושי שהוצעו אלטרנטיבה חדשה עבור רפואה רגנרטיבית אישית17. החולה נגזר iPSCs אישית משקפים את מאפייני המטופל יכול לשמש עבור מידול המחלה, והתרופות הקרנה עצמיים השתלת18,19. השימוש iPSCs נגזר החולה יכול גם להתגבר על בעיות לגבי ראשי תאים, חוסר מספרי הטלפ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק של קוריאה בריאות טכנולוגיית R & D הפרוייקט, משרד הבריאות, הרווחה, ענייני משפחה, הרפובליקה של קוריאה (H16C2177, H18C1178).
Materials
| Adenine | Sigma | A2786 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| AggreWell Medium (EB formation medium) | STEMCELL | 05893 | EB formation |
| Anti-Fibronectin antibody | abcam | ab23750 | Fibroblast marker |
| Anti-KRT14 antibody | abcam | ab7800 | Keratinocyte marker |
| Anti-Loricrin antibody | abcam | ab85679 | Stratum corneum marker |
| Anti-p63 antibody | abcam | ab124762 | Keratinocyte marker |
| Anti-Vimentin antibody | Santa cruz | sc-7558 | Fibroblast marker |
| BAND AID FLEXIBLE FABRIC | Johnson & Johnson | – | Bandage |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | BD | 354277 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| BLACK SILK suture | AILEEE | SK617 | Skin graft |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Collagen type I | BD | 354236 | 3D skin organoid |
| Collagen type IV | Santa-cruz | sc-29010 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Defined keratinocyte-Serum Free Medium | Gibco | 10744-019 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11995065 | Component of differentiation medium |
| DMEM/F12 Medium | Gibco | 11330-032 | Component of differentiation medium |
| Essential 8 medium | Gibco | A1517001 | iPSC medium |
| FBS, Qualified | Corning | 35-015-CV | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Glutamax Supplement | Gibco | 35050061 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Insulin | Invtrogen | 12585-014 | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Iris standard curved scissor | Professional | PC-02.10 | Surgical instrument |
| Keratinocyte Serum Free Medium | Gibco | 17005-042 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| MEM Non-Essential Amino Acid | Gibco | 1140050 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Meriam Forceps Thumb 16 cm | HIROSE | HC 2265-1 | Surgical instrument |
| NOD.CB17-Prkdc SCID/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice strain for skin graft |
| Petri dish 90 mm | Hyundai Micro | H10090 | Plastic ware |
| Recombinant Human BMP-4 | R&D | 314-BP | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Recombinant human EGF protein | R&D | 236-EG | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| T/C Petridish 100 mm, 240/bx | TPP | 93100 | Plastic ware |
| Transferrin | Sigma | T3705 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Transwell-COL collagen-coated membrane inserts | Corning | CLS3492 | Plastic ware for 3D skin organoid |
| Vitronectin | Life technologies | A14700 | iPSC culture |
| Y-27632 Dihydrochloride | peprotech | 1293823 | iPSC culture |
References
- Vincent, J. F., Bogatyreva, O. A., Bogatyrev, N. R., Bowyer, A., Pahl, A. K. Biomimetics: its practice and theory. Journal of The Royal Society Interface. 3 (9), 471-482 (2006).
- Madison, K. C. Barrier function of the skin: “la raison d’etre” of the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 121 (2), 231-241 (2003).
- Chen, M., Przyborowski, M., Berthiaume, F. Stem cells for skin tissue engineering and wound healing. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 37 (4-5), 399-421 (2009).
- Dixit, S., et al. Immunological challenges associated with artificial skin grafts: available solutions and stem cells in future design of synthetic skin. Journal of Biological Engineering. 11, 49 (2017).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10 (6), 678-684 (2012).
- Yamanaka, S. Pluripotency and nuclear reprogramming. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363 (1500), 2079-2087 (2008).
- Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The potential for immunogenicity of autologous induced pluripotent stem cell-derived therapies. Journal of Biological Chemistry. 289 (8), 4571-4577 (2014).
- Zimmermann, A., Preynat-Seauve, O., Tiercy, J. M., Krause, K. H., Villard, J. Haplotype-based banking of human pluripotent stem cells for transplantation: potential and limitations. Stem Cells and Development. 21 (13), 2364-2373 (2012).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Terasaki, P. I. A brief history of HLA. Immunologic Research. 38 (1-3), 139-148 (2007).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Rim, Y. A., et al. Recent progress of national banking project on homozygous HLA-typed induced pluripotent stem cells in South Korea. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 1531-1536 (2018).
- Nakatsuji, N., Nakajima, F., Tokunaga, K. HLA-haplotype banking and iPS cells. Nature Biotechnology. 26 (7), 739-740 (2008).
- Pappas, D. J., et al. Proceedings: human leukocyte antigen haplo-homozygous induced pluripotent stem cell haplobank modeled after the california population: evaluating matching in a multiethnic and admixed population. Stem Cells Translational Medicine. 4 (5), 413-418 (2015).
- Embryoid body formation from human pluripotent stem cells in chemically defined E8 media. StemBook Available from: https://www.stembook.org/node/6632 (2008)
- Kim, Y., et al. Establishment of a complex skin structure via layered co-culture of keratinocytes and fibroblasts derived from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 217 (2018).
- Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. The Korean Journal of Internal Medicine. 29 (5), 547-557 (2014).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
- Pham, T. L., Nguyen, T. T., Van Bui, A., Nguyen, M. T., Van Pham, P. Fetal heart extract facilitates the differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into heart muscle precursor cells. Cytotechnology. 68 (4), 645-658 (2016).
- Stecklum, M., et al. Cell differentiation mediated by co-culture of human umbilical cord blood stem cells with murine hepatic cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 51 (2), 183-191 (2015).
- Nam, Y., Rim, Y. A., Ju, J. H. Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (124), e55988 (2017).
- Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Application of Cord Blood and Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells for Cartilage Regeneration. Cell Transplantation. , (2018).
- Shevde, N. K., Mael, A. A. Techniques in embryoid body formation from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 946, 535-546 (2013).
- Shamis, Y., et al. iPSC-derived fibroblasts demonstrate augmented production and assembly of extracellular matrix proteins. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 48 (2), 112-122 (2012).
- Bikle, D. D., Xie, Z., Tu, C. L. Calcium regulation of keratinocyte differentiation. Expert Review of Endocrinology & Metabolism. 7 (4), 461-472 (2012).
- Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. Keratinocytes grown at the air-liquid interface. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 22 (12), 695-705 (1986).
- Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. Journal of Investigative Dermatology. 81, 28-33 (1983).
- Steven, A. C., Bisher, M. E., Roop, D. R., Steinert, P. M. Biosynthetic pathways of filaggrin and loricrin–two major proteins expressed by terminally differentiated epidermal keratinocytes. Journal of Structural Biology. 104 (1-3), 150-162 (1990).
- Hohl, D., et al. Characterization of human loricrin. Structure and function of a new class of epidermal cell envelope proteins. Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6626-6636 (1991).
- Bern, R., et al. Original and modified technique of tie-over dressing: Method and application in burn patients. Burns. 44 (5), 1357-1360 (2018).
- Joyce, C. W., Joyce, K. M., Kennedy, A. M., Kelly, J. L. The Running Barbed Tie-over Dressing. Plastic and Reconstructive Surgery – Global Open. 2 (4), 137 (2014).
- Wang, C. K., Nelson, C. F., Brinkman, A. M., Miller, A. C., Hoeffler, W. K. Spontaneous cell sorting of fibroblasts and keratinocytes creates an organotypic human skin equivalent. Journal of Investigative Dermatology. 114 (4), 674-680 (2000).
- Yang, R., et al. Generation of folliculogenic human epithelial stem cells from induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 5, 3071 (2014).
