Summary

דור של תא צורב עור תלת-ממד של כבל דם-derived המושרה בתאי גזע Pluripotent

Published: April 18, 2019
doi:

Summary

אנו מציעים פרוטוקול זה מראה כיצד להבדיל keratinocytes נגזר תאי גזע pluripotent המושרה ו fibroblasts וליצור תא צורב של העור תלת-ממד באמצעות אלה keratinocytes ו fibroblasts. פרוטוקול זה מכיל צעד נוסף של יצירת מודל humanized עכברים. הטכניקה המובאת כאן תשפר את המחקר דרמטולוגית.

Abstract

העור הוא האיבר הגדול ביותר בגוף, יש פונקציות רבות. העור משמש מחסום פיסי, מגן על הגוף, מווסת את התפקודים הגופניים. ביומימטיקה היא החיקוי של דגמים, מערכות ורכיבים של הטבע לצורך פתרון בעיות אנושיות מורכבות1. ביומימטיקה העור הוא כלי שימושי עבור רפואה רגנרטיבית ויוו ומחקר במחלה במבחנה. תאי גזע pluripotent המושרה אנושי (iPSCs) יש על מאפייני התפשטות ללא הגבלה את היכולת של בידול שלוש שכבות הנבט. IPSCs האנושי נוצרים מתאי ראשי שונים, כגון תאי דם, keratinocytes, fibroblasts ועוד. ביניהם, כבל תאי תאי דם (CBMCs) הופיעו כמקור חלופי תא מנקודת המבט של רפואה רגנרטיבית allogeneic. CBMCs הם שימושי רפואה רגנרטיבית כי הקלדת אנטיגן (הלע) לויקוציטים אנושיים חיוני לתא מערכת בנקאות. אנו מספקים שיטה את הבידול של CBMC-iPSCs לתוך keratinocytes ו fibroblasts ועל הדור של תא צורב העור תלת-ממד. Keratinocytes CBMC iPSC-נגזר fibroblasts יש מאפיינים דומים לקו התא הראשי. Organoids העור תלת-ממד נוצרות על-ידי השלכת של שיכבת אל שכבת הדרמיס. מאת משתילים תא צורב את העור תלת-ממד, נוצר מודל humanized עכברים. מחקר זה מראה כי תא צורב תלת-ממד עור האדם הנגזרות iPSC עשוי להיות כלי הרומן חלופי למחקר דרמטולוגית במבחנה, ויוו.

Introduction

העור המכסה את פני השטח החיצוני של הגוף ומגנה על האיברים הפנימיים. לעור יש פונקציות שונות, כולל הגנה מפני פתוגנים, קליטת ואחסון מים, לווסת את טמפרטורת הגוף, הגוף מפריש לבזבז2. שתלי העור יכולים להיות מסווגים בהתאם לסוג מקור העור; שתלי באמצעות העור עוד תורם מכונים allografts, שתלי העור של המטופל באמצעות autografts. למרות בשתל הטיפול המועדפת עקב סיכון נמוך הדחייה שלה, ביופסיות עור קשים לביצוע על חולים עם פצעים חמורים או מספר לא מספיק של תאי העור. בחולים עם כוויות חמורות, שלוש פעמים את מספר תאי העור נחוצים לכסות שטחים גדולים. המוגבל של תאי עור מגופו של החולה תוצאות במצבים איפה השתלת allogenous הכרחי. יודע משמש באופן זמני עד עצמיים השתלת יכול להתבצע מאז היא בדרך כלל נדחית על ידי המערכת החיסונית של המחשב המארח לאחר כ שבוע 13. כדי להתגבר על דחייה על ידי המערכת החיסונית של החולה, שתלי חייב לבוא ממקור עם זהות המערכת החיסונית אותו כמו החולה4.

IPSCs האנושי הם מקור המתעוררים של תאים עבור טיפול בתאי גזע5. IPSCs האנושי נוצרים תאים סומטיים, באמצעות גורמים התיכנות כגון OCT4, SOX2, Klf4 ו- c-Myc6. שימוש iPSCs האדם מתגבר על בעיות אתיות ו של תאי גזע עובריים (ESCs)7,8. IPSCs האנושי יש pluripotency, יכולים להתמיין שלוש שכבות הנבט9. הנוכחות של הלע, גורם קריטי רפואה רגנרטיבית, קובע את התגובה החיסונית ועל האפשרות של דחיית10. השימוש של החולה, נגזר iPSCs פותר הבעיות של התא-מקור דחייה הגבלה ואת המערכת החיסונית. CBMCs הופיעו גם כמקור תא חלופי עבור רפואה רגנרטיבית11. הלע חובה להקליד, אשר מתרחש במהלך CBMC בנקאות, יכול לשמש בקלות עבור מחקר והשתלות. IPSCs הלע-סוג נוסף, homozygous נרחב ניתן להחיל על מטופלים שונים12. בנק CBMC-iPSC הוא רומן, אסטרטגיה יעילה עבור טיפול בתאי ו רפואה רגנרטיבית allogenic12,13,14. במחקר זה, אנו משתמשים CBMC-iPSCs, הבדיל keratinocytes ו fibroblasts, וצור שכבות העור 3D מרובדת. תוצאות של מחקר זה מציע כי תא צורב CBMC iPSC-נגזר עור תלת-ממד הוא כלי הרומן למחקר דרמטולוגית במבחנה, ויוו.

Protocol

בכל ההליכים הכרוכים חיות בוצעו על פי חוק רווחת חיות מעבדה, המדריך הטיפול ואת השימוש של חיות מעבדה, וסיפק הנחיות ומדיניות לניסויים מכרסם אכפת חיה מוסדיים ו השתמש הוועד (IACUC) של בית הספר לרפואה של האוניברסיטה הקתולית של קוריאה. פרוטוקול המחקר אושרה על ידי ועדת הבדיקה המוסדי של האוניברסיטה הק?…

Representative Results

העור מורכב, ברוב המקרים, ושל האפידרמיס הדרמיס. Keratinocytes הן סוג התא העיקרי של האפידרמיס, fibroblasts הם סוג התא העיקרי של הדרמיס. התכנית של בידול תקין מוצג איור 1א’. CBMC-iPCSc היו מתוחזקים מאכל מצופה vitronectin (איור 1B). במחקר זה, אנחנו הבדיל CBMC-iPSCs לתוך keratinocyt…

Discussion

IPSCs האנושי שהוצעו אלטרנטיבה חדשה עבור רפואה רגנרטיבית אישית17. החולה נגזר iPSCs אישית משקפים את מאפייני המטופל יכול לשמש עבור מידול המחלה, והתרופות הקרנה עצמיים השתלת18,19. השימוש iPSCs נגזר החולה יכול גם להתגבר על בעיות לגבי ראשי תאים, חוסר מספרי הטלפ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענק של קוריאה בריאות טכנולוגיית R & D הפרוייקט, משרד הבריאות, הרווחה, ענייני משפחה, הרפובליקה של קוריאה (H16C2177, H18C1178).

Materials

Adenine Sigma A2786 Component of differentiation medium for fibroblast
AggreWell Medium (EB formation medium) STEMCELL 05893 EB formation
Anti-Fibronectin antibody abcam ab23750 Fibroblast marker
Anti-KRT14 antibody abcam ab7800 Keratinocyte marker
Anti-Loricrin antibody abcam ab85679 Stratum corneum marker
Anti-p63 antibody abcam ab124762 Keratinocyte marker
Anti-Vimentin antibody Santa cruz sc-7558 Fibroblast marker
BAND AID FLEXIBLE FABRIC Johnson & Johnson Bandage
Basement membrane matrix (Matrigel) BD 354277 Component of differentiation medium for fibroblast
BLACK SILK suture AILEEE SK617 Skin graft
CaCl2 Sigma C5670 Component of epithelial medium for 3D skin organoid
Collagen type I BD 354236 3D skin organoid
Collagen type IV Santa-cruz sc-29010 Component of differentiation medium for keratinocyte
Defined keratinocyte-Serum Free Medium Gibco 10744-019 Component of differentiation medium for keratinocyte
DMEM, high glucose Gibco 11995065 Component of differentiation medium
DMEM/F12 Medium Gibco 11330-032 Component of differentiation medium
Essential 8 medium Gibco A1517001 iPSC medium
FBS, Qualified Corning 35-015-CV Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte
Glutamax Supplement  Gibco 35050061 Component of differentiation medium for fibroblast
Insulin Invtrogen 12585-014 Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte
Iris standard curved scissor Professional PC-02.10 Surgical instrument
Keratinocyte Serum Free Medium Gibco 17005-042 Component of differentiation medium for keratinocyte
L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrate Sigma A8960 Component of differentiation medium for keratinocyte
MEM Non-Essential Amino Acid Gibco 1140050 Component of differentiation medium for fibroblast
Meriam Forceps Thumb 16 cm HIROSE HC 2265-1 Surgical instrument
NOD.CB17-Prkdc SCID/J The Jackson Laboratory 001303 Mice strain for skin graft
Petri dish 90 mm Hyundai Micro H10090 Plastic ware
Recombinant Human BMP-4 R&D 314-BP Component of differentiation medium for keratinocyte
Recombinant human EGF protein R&D 236-EG Component of differentiation medium for keratinocyte
Retinoic acid Sigma R2625 Component of differentiation medium for keratinocyte
T/C Petridish 100 mm, 240/bx TPP 93100 Plastic ware
Transferrin Sigma T3705 Component of epithelial medium for 3D skin organoid
Transwell-COL collagen-coated membrane inserts  Corning CLS3492 Plastic ware for 3D skin organoid 
Vitronectin Life technologies A14700 iPSC culture
Y-27632 Dihydrochloride peprotech 1293823 iPSC culture

References

  1. Vincent, J. F., Bogatyreva, O. A., Bogatyrev, N. R., Bowyer, A., Pahl, A. K. Biomimetics: its practice and theory. Journal of The Royal Society Interface. 3 (9), 471-482 (2006).
  2. Madison, K. C. Barrier function of the skin: “la raison d’etre” of the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 121 (2), 231-241 (2003).
  3. Chen, M., Przyborowski, M., Berthiaume, F. Stem cells for skin tissue engineering and wound healing. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 37 (4-5), 399-421 (2009).
  4. Dixit, S., et al. Immunological challenges associated with artificial skin grafts: available solutions and stem cells in future design of synthetic skin. Journal of Biological Engineering. 11, 49 (2017).
  5. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10 (6), 678-684 (2012).
  6. Yamanaka, S. Pluripotency and nuclear reprogramming. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363 (1500), 2079-2087 (2008).
  7. Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The potential for immunogenicity of autologous induced pluripotent stem cell-derived therapies. Journal of Biological Chemistry. 289 (8), 4571-4577 (2014).
  8. Zimmermann, A., Preynat-Seauve, O., Tiercy, J. M., Krause, K. H., Villard, J. Haplotype-based banking of human pluripotent stem cells for transplantation: potential and limitations. Stem Cells and Development. 21 (13), 2364-2373 (2012).
  9. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  10. Terasaki, P. I. A brief history of HLA. Immunologic Research. 38 (1-3), 139-148 (2007).
  11. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  12. Rim, Y. A., et al. Recent progress of national banking project on homozygous HLA-typed induced pluripotent stem cells in South Korea. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 1531-1536 (2018).
  13. Nakatsuji, N., Nakajima, F., Tokunaga, K. HLA-haplotype banking and iPS cells. Nature Biotechnology. 26 (7), 739-740 (2008).
  14. Pappas, D. J., et al. Proceedings: human leukocyte antigen haplo-homozygous induced pluripotent stem cell haplobank modeled after the california population: evaluating matching in a multiethnic and admixed population. Stem Cells Translational Medicine. 4 (5), 413-418 (2015).
  15. Embryoid body formation from human pluripotent stem cells in chemically defined E8 media. StemBook Available from: https://www.stembook.org/node/6632 (2008)
  16. Kim, Y., et al. Establishment of a complex skin structure via layered co-culture of keratinocytes and fibroblasts derived from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 217 (2018).
  17. Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. The Korean Journal of Internal Medicine. 29 (5), 547-557 (2014).
  18. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  19. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
  20. Pham, T. L., Nguyen, T. T., Van Bui, A., Nguyen, M. T., Van Pham, P. Fetal heart extract facilitates the differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into heart muscle precursor cells. Cytotechnology. 68 (4), 645-658 (2016).
  21. Stecklum, M., et al. Cell differentiation mediated by co-culture of human umbilical cord blood stem cells with murine hepatic cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 51 (2), 183-191 (2015).
  22. Nam, Y., Rim, Y. A., Ju, J. H. Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (124), e55988 (2017).
  23. Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Application of Cord Blood and Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells for Cartilage Regeneration. Cell Transplantation. , (2018).
  24. Shevde, N. K., Mael, A. A. Techniques in embryoid body formation from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 946, 535-546 (2013).
  25. Shamis, Y., et al. iPSC-derived fibroblasts demonstrate augmented production and assembly of extracellular matrix proteins. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 48 (2), 112-122 (2012).
  26. Bikle, D. D., Xie, Z., Tu, C. L. Calcium regulation of keratinocyte differentiation. Expert Review of Endocrinology & Metabolism. 7 (4), 461-472 (2012).
  27. Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. Keratinocytes grown at the air-liquid interface. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 22 (12), 695-705 (1986).
  28. Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. Journal of Investigative Dermatology. 81, 28-33 (1983).
  29. Steven, A. C., Bisher, M. E., Roop, D. R., Steinert, P. M. Biosynthetic pathways of filaggrin and loricrin–two major proteins expressed by terminally differentiated epidermal keratinocytes. Journal of Structural Biology. 104 (1-3), 150-162 (1990).
  30. Hohl, D., et al. Characterization of human loricrin. Structure and function of a new class of epidermal cell envelope proteins. Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6626-6636 (1991).
  31. Bern, R., et al. Original and modified technique of tie-over dressing: Method and application in burn patients. Burns. 44 (5), 1357-1360 (2018).
  32. Joyce, C. W., Joyce, K. M., Kennedy, A. M., Kelly, J. L. The Running Barbed Tie-over Dressing. Plastic and Reconstructive Surgery – Global Open. 2 (4), 137 (2014).
  33. Wang, C. K., Nelson, C. F., Brinkman, A. M., Miller, A. C., Hoeffler, W. K. Spontaneous cell sorting of fibroblasts and keratinocytes creates an organotypic human skin equivalent. Journal of Investigative Dermatology. 114 (4), 674-680 (2000).
  34. Yang, R., et al. Generation of folliculogenic human epithelial stem cells from induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 5, 3071 (2014).

Play Video

Cite This Article
Kim, Y., Ju, J. H. Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (146), e59297, doi:10.3791/59297 (2019).

View Video