Поколение 3D кожи органоид из пуповинной крови производные индуцированных плюрипотентных стволовых клеток
Summary
Мы предлагаем протокол, который показывает, как для дифференциации кератиноцитов индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и фибробластов и создания 3D кожи органоид, используя эти кератиноцитов и фибробластов. Этот протокол содержит дополнительный шаг генерации модели гуманизированные мышей. Техника, представленная здесь будет улучшить дерматологические исследования.
Abstract
Кожа является крупнейшим органом органа и имеет множество функций. Кожа действует как физический барьер и защитник тела и регулирует функции организма. Биомиметики это имитация моделей, систем и элементов природы с целью решения сложных проблем человека1. Биомиметики кожи является полезным инструментом для исследований в пробирке болезней и в естественных условиях восстановительной медицины. Человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) имеют характеристику неограниченного распространения и способность дифференциации три зародышевых. Человеческого iPSCs генерируются из различных начальных клеток, таких как клетки крови, кератиноциты, фибробласты и многое другое. Среди них мононуклеарных клеток пуповинной крови (CBMCs) появились как источник альтернативной ячейки с точки зрения аллогенной регенеративной медицины. CBMCs являются полезными в регенеративной медицине, потому что человеческий лейкоцитарный антиген (HLA) ввод имеет важное значение для ячейки, банковской системы. Мы предоставляем метод дифференциации СВМС iPSCs в кератиноцитов и фибробластов и для поколения органоид 3D кожи. СВМС iPSC производные кератиноцитов и фибробласты имеют характеристики похож на главной ячейки строки. Organoids 3D кожи генерируются путем наложения эпидермального слоя на слой дермы. По пересадке этой 3D кожи органоид, формируется модель гуманизированные мышей. Это исследование показывает, что органоид 3D человеческого iPSC производные кожи может быть роман, альтернативные инструментом дерматологических исследований в vitro и in vivo.
Introduction
Кожа покрывает внешней поверхности тела и защищает внутренние органы. Кожа имеет различные функции, в том числе защиты от патогенов, поглощая и хранения воды, регулирование температуры тела и выделяют тела отходов2. Пересадке кожи могут быть классифицированы в зависимости от источника кожи; графтов, использование кожи от другого донора называются аллотрансплантантов, и трансплантатов, используя кожи пациента являются аутотрансплантантов. Хотя аутотрансплантатом является предпочтительным лечения из-за его низкой неприятие риска, биопсия кожи, трудно выполнить на пациентов с серьезными повреждениями или недостаточное количество клеток кожи. У больных с ожогами в три раза количество клеток кожи необходимы для покрытия больших территорий. В ситуациях, когда необходима трансплантация аллогенных приводит ограниченное количество клеток кожи от тела пациента. Аллотрансплантата используется временно, до аутологичной трансплантации может быть выполнена, поскольку обычно оно отклоняется иммунной системой хозяина, после примерно 1 неделю3. Чтобы преодолеть неприятие иммунной системой пациента, графтов должна исходить от источника с тем же идентификатором иммунитета пациента4.
Человеческого iPSCs являются источником новых клеток для клеточной терапии5. Человеческого iPSCs генерируются из соматических клеток, используя перепрограммирования факторов, таких как OCT4, SOX2, Klf4 и c-Myc6. С помощью человеческого iPSCs преодолевает этические и иммунологические аспекты эмбриональных стволовых клеток (ЭСК)7,8. Человеческого iPSCs имеют плюрипотентности и могут дифференцироваться в три зародышевых9. Наличие HLA, решающим фактором в регенеративной медицине, определяет иммунный ответ и возможность отказа10. Использование пациента производные iPSCs решает проблемы отказа ограничения и иммунной системы клетки источник. CBMCs также стали источником альтернативной ячейки для регенеративной медицины11. Обязательное HLA набрав, которая происходит во время СВМС банковской, легко может использоваться для исследования и трансплантации. Кроме того, гомозиготных HLA-типа iPSCs может широко применяют для различных пациентов12. СВМС iPSC банк — Роман и эффективную стратегию для клеточной терапии и аллогенных регенеративной медицины12,,1314. В этом исследовании мы используем СВМС iPSCs, дифференцированные в кератиноцитов и фибробластов и генерировать слои стратифицированной 3D кожи. Результаты этого исследования свидетельствуют о СВМС iPSC производные 3D кожи органоид Роман инструмент для в vitro и in vivo дерматологические исследования.
Protocol
Representative Results
Discussion
Как новая альтернатива для персональной восстановительной медицины17было предложено человека iPSCs. Пациент производные персонализированные iPSCs отражают пациента характеристики, которые могут использоваться для моделирования заболевания, наркотиков скрининг и аутологич?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грант от Кореи здравоохранения технологии R & D проекта, Министерство здравоохранения, благосостояния и делам семьи, Республика Корея (H16C2177, H18C1178).
Materials
| Adenine | Sigma | A2786 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| AggreWell Medium (EB formation medium) | STEMCELL | 05893 | EB formation |
| Anti-Fibronectin antibody | abcam | ab23750 | Fibroblast marker |
| Anti-KRT14 antibody | abcam | ab7800 | Keratinocyte marker |
| Anti-Loricrin antibody | abcam | ab85679 | Stratum corneum marker |
| Anti-p63 antibody | abcam | ab124762 | Keratinocyte marker |
| Anti-Vimentin antibody | Santa cruz | sc-7558 | Fibroblast marker |
| BAND AID FLEXIBLE FABRIC | Johnson & Johnson | – | Bandage |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | BD | 354277 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| BLACK SILK suture | AILEEE | SK617 | Skin graft |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Collagen type I | BD | 354236 | 3D skin organoid |
| Collagen type IV | Santa-cruz | sc-29010 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Defined keratinocyte-Serum Free Medium | Gibco | 10744-019 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11995065 | Component of differentiation medium |
| DMEM/F12 Medium | Gibco | 11330-032 | Component of differentiation medium |
| Essential 8 medium | Gibco | A1517001 | iPSC medium |
| FBS, Qualified | Corning | 35-015-CV | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Glutamax Supplement | Gibco | 35050061 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Insulin | Invtrogen | 12585-014 | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Iris standard curved scissor | Professional | PC-02.10 | Surgical instrument |
| Keratinocyte Serum Free Medium | Gibco | 17005-042 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| MEM Non-Essential Amino Acid | Gibco | 1140050 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Meriam Forceps Thumb 16 cm | HIROSE | HC 2265-1 | Surgical instrument |
| NOD.CB17-Prkdc SCID/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice strain for skin graft |
| Petri dish 90 mm | Hyundai Micro | H10090 | Plastic ware |
| Recombinant Human BMP-4 | R&D | 314-BP | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Recombinant human EGF protein | R&D | 236-EG | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| T/C Petridish 100 mm, 240/bx | TPP | 93100 | Plastic ware |
| Transferrin | Sigma | T3705 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Transwell-COL collagen-coated membrane inserts | Corning | CLS3492 | Plastic ware for 3D skin organoid |
| Vitronectin | Life technologies | A14700 | iPSC culture |
| Y-27632 Dihydrochloride | peprotech | 1293823 | iPSC culture |
References
- Vincent, J. F., Bogatyreva, O. A., Bogatyrev, N. R., Bowyer, A., Pahl, A. K. Biomimetics: its practice and theory. Journal of The Royal Society Interface. 3 (9), 471-482 (2006).
- Madison, K. C. Barrier function of the skin: “la raison d’etre” of the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 121 (2), 231-241 (2003).
- Chen, M., Przyborowski, M., Berthiaume, F. Stem cells for skin tissue engineering and wound healing. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 37 (4-5), 399-421 (2009).
- Dixit, S., et al. Immunological challenges associated with artificial skin grafts: available solutions and stem cells in future design of synthetic skin. Journal of Biological Engineering. 11, 49 (2017).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10 (6), 678-684 (2012).
- Yamanaka, S. Pluripotency and nuclear reprogramming. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363 (1500), 2079-2087 (2008).
- Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The potential for immunogenicity of autologous induced pluripotent stem cell-derived therapies. Journal of Biological Chemistry. 289 (8), 4571-4577 (2014).
- Zimmermann, A., Preynat-Seauve, O., Tiercy, J. M., Krause, K. H., Villard, J. Haplotype-based banking of human pluripotent stem cells for transplantation: potential and limitations. Stem Cells and Development. 21 (13), 2364-2373 (2012).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Terasaki, P. I. A brief history of HLA. Immunologic Research. 38 (1-3), 139-148 (2007).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Rim, Y. A., et al. Recent progress of national banking project on homozygous HLA-typed induced pluripotent stem cells in South Korea. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 1531-1536 (2018).
- Nakatsuji, N., Nakajima, F., Tokunaga, K. HLA-haplotype banking and iPS cells. Nature Biotechnology. 26 (7), 739-740 (2008).
- Pappas, D. J., et al. Proceedings: human leukocyte antigen haplo-homozygous induced pluripotent stem cell haplobank modeled after the california population: evaluating matching in a multiethnic and admixed population. Stem Cells Translational Medicine. 4 (5), 413-418 (2015).
- Embryoid body formation from human pluripotent stem cells in chemically defined E8 media. StemBook Available from: https://www.stembook.org/node/6632 (2008)
- Kim, Y., et al. Establishment of a complex skin structure via layered co-culture of keratinocytes and fibroblasts derived from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 217 (2018).
- Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. The Korean Journal of Internal Medicine. 29 (5), 547-557 (2014).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
- Pham, T. L., Nguyen, T. T., Van Bui, A., Nguyen, M. T., Van Pham, P. Fetal heart extract facilitates the differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into heart muscle precursor cells. Cytotechnology. 68 (4), 645-658 (2016).
- Stecklum, M., et al. Cell differentiation mediated by co-culture of human umbilical cord blood stem cells with murine hepatic cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 51 (2), 183-191 (2015).
- Nam, Y., Rim, Y. A., Ju, J. H. Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (124), e55988 (2017).
- Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Application of Cord Blood and Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells for Cartilage Regeneration. Cell Transplantation. , (2018).
- Shevde, N. K., Mael, A. A. Techniques in embryoid body formation from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 946, 535-546 (2013).
- Shamis, Y., et al. iPSC-derived fibroblasts demonstrate augmented production and assembly of extracellular matrix proteins. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 48 (2), 112-122 (2012).
- Bikle, D. D., Xie, Z., Tu, C. L. Calcium regulation of keratinocyte differentiation. Expert Review of Endocrinology & Metabolism. 7 (4), 461-472 (2012).
- Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. Keratinocytes grown at the air-liquid interface. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 22 (12), 695-705 (1986).
- Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. Journal of Investigative Dermatology. 81, 28-33 (1983).
- Steven, A. C., Bisher, M. E., Roop, D. R., Steinert, P. M. Biosynthetic pathways of filaggrin and loricrin–two major proteins expressed by terminally differentiated epidermal keratinocytes. Journal of Structural Biology. 104 (1-3), 150-162 (1990).
- Hohl, D., et al. Characterization of human loricrin. Structure and function of a new class of epidermal cell envelope proteins. Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6626-6636 (1991).
- Bern, R., et al. Original and modified technique of tie-over dressing: Method and application in burn patients. Burns. 44 (5), 1357-1360 (2018).
- Joyce, C. W., Joyce, K. M., Kennedy, A. M., Kelly, J. L. The Running Barbed Tie-over Dressing. Plastic and Reconstructive Surgery – Global Open. 2 (4), 137 (2014).
- Wang, C. K., Nelson, C. F., Brinkman, A. M., Miller, A. C., Hoeffler, W. K. Spontaneous cell sorting of fibroblasts and keratinocytes creates an organotypic human skin equivalent. Journal of Investigative Dermatology. 114 (4), 674-680 (2000).
- Yang, R., et al. Generation of folliculogenic human epithelial stem cells from induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 5, 3071 (2014).
