جيل أورجانويد الجلد 3D من سلك المستمدة من الدم الناجم عن الخلايا الجذعية Pluripotent
Summary
ونحن نقترح بروتوكول يوضح كيفية التفريق بين الخلايا الكيراتينيه المستمدة من الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent والليفية وتوليد أورجانويد جلد 3D، استخدام هذه الخلايا الكيراتينيه والليفية. ويتضمن هذا البروتوكول خطوة إضافية لتوليد نموذج فئران أنسنة. هذه التقنية المقدمة هنا سيحسن البحوث الجلد.
Abstract
الجلد هو أكبر جهاز في الجسم، والعديد من الوظائف. الجلد ويعمل كحاجز مادي والحامي للجسم وينظم وظائف الجسم. بيوميميتيقا هو تقليد النماذج والنظم، وعناصر الطبيعة تهدف إلى حل المشاكل الإنسانية المعقدة1. بيوميميتيقا الجلد أداة مفيدة للبحوث في مجال الأمراض في المختبر والمجراه في الطب التجديدي. وقد الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (إيبسكس) أن الخاصية غير محدود الانتشار وقدرة التمايز على الطبقات الجرثومية الثلاث. يتم إنشاء إيبسكس البشرية من الخلايا الأولية المختلفة، مثل خلايا الدم والخلايا الكيراتينيه والليفية وأكثر. فيما بينها، ظهرت الخلايا وحيدات النوى دم الحبل (كبمكس) كمصدر لخلايا بديلة من منظور الطب التجديدي متمكنة. كبمكس مفيدة في الطب التجديدي لكتابة (هلا) مستضد الكريات البيض البشرية ضروري للخلية النظام المصرفي. نحن نقدم طريقة للتفريق بين إيبسكس كبمك الكيراتينيه والليفية وجيل من أورجانويد الجلد 3D. المستمدة من اللجنة التوجيهية كبمك الكيراتينيه والليفية لها خصائص مماثلة لخط خلية الأولية. أورجانويدس 3D الجلد يتم إنشاؤها بواسطة تراكب طبقة البشرة على طبقة الجلد. بزرع أورجانويد الجلد ثلاثية الأبعاد هذه، يتم إنشاء نموذج فئران أنسنة. وتبين هذه الدراسة أن أورجانويد 3D جلد الإنسان المستمدة من اللجنة التوجيهية قد تكون أداة جديدة وبديلة لبحوث الجلد في المختبر والمجراه.
Introduction
الجلد يغطي سطح الأبعد من الجسم، ويحمي الأعضاء الداخلية. الجلد وظائف مختلفة، بما في ذلك حماية ضد العوامل الممرضة وامتصاص وتخزين المياه، وتنظيم درجة حرارة الجسم، والتغوط الجسم النفايات2. ترقيع الجلد يمكن أن تصنف تبعاً لمصدر الجلد؛ وتسمى ترقيع الجلد من مانح آخر باستخدام اللوجرافتس، وترقيع الجلد للمريض باستخدام أوتوجرافتس. على الرغم من أن أوتوجرافت هو العلاج المفضل بسبب رفض منخفضة المخاطر، خزعات الجلد يصعب القيام به في المرضى الذين يعانون من آفات شديدة أو عدد غير كاف من خلايا الجلد. في المرضى الذين يعانون من حروق شديدة، ثلاث مرات عدد خلايا الجلد ضرورية لتغطية مساحات كبيرة. التوفر المحدود لخلايا الجلد من جسم المريض النتائج في الحالات التي يلزم فيها زرع اللوجينوس. Allograft يستخدم مؤقتاً حتى يمكن إجراء الزرع الذاتي حيث عادة ما رفضه من قبل النظام المناعي للمضيف بعد قرابة أسبوع واحد3. للتغلب على الرفض المناعي للمريض، يجب أن تأتي الطعوم من مصدر بنفس الهوية المناعية ك المريض4.
إيبسكس البشرية مصدرا ناشئة من الخلايا للخلايا الجذعية العلاج5. يتم إنشاء إيبسكس البشرية من خلايا جسدية، باستخدام عوامل إعادة برمجة مثل OCT4، SOX2، Klf4، وحركة ج6. استخدام إيبسكس البشرية ويتغلب على المسائل الأخلاقية والمناعية للخلايا الجذعية الجنينية (بتوليدا)،من78. وقد بلوريبوتينسي إيبسكس البشرية ويمكن أن تفرق في الطبقات الجرثومية الثلاث9. وجود هلا، عاملاً حاسما في الطب التجديدي، يحدد الاستجابة المناعية، وإمكانية رفض10. استخدام إيبسكس المستمدة من المريض يحل مشاكل رفض نظام المناعة والحد من الخلية المصدر. وظهرت أيضا كمصدر لخلايا بديلة للطب التجديدي11كبمكس. هلا إلزامية كتابة، الذي يحدث أثناء كبمك المصرفية، يمكن استخدامها بسهولة للبحوث، وزرع الأعضاء. يمكن تطبيق إيبسكس هلا من نوع متماثل، وكذلك على نطاق واسع لمختلف المرضى12. وهو مصرف كبمك-اللجنة التوجيهية الرواية واستراتيجية فعالة لعلاج الخلايا والطب التجديدي allogenic12،،من1314. في هذه الدراسة، ونحن نستخدم كبمك-إيبسكس، متباينة في الخلايا الكيراتينيه والليفية، وتكوين طبقات الجلد 3D طبقية. نتائج هذه الدراسة تشير إلى أن أورجانويد المستمدة من اللجنة التوجيهية كبمك 3D جلد أداة جديدة للبحوث في المختبر والمجراه في الجلد.
Protocol
Representative Results
Discussion
إيبسكس البشرية وقد اقترحت كبديل جديد للطب التجديدي شخصية17. وتعكس المستمدة من المريض إيبسكس شخصية المريض من الخصائص التي يمكن استخدامها للنمذجة المرض وفحص المخدرات والزرع الذاتي18،19. كما يمكن استخدام إيبسكس المستمدة من المريض من التغلب على الم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل بمنحه من كوريا الرعاية الصحية تكنولوجيا البحث والتطوير المشروع د، وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية و “شؤون الأسرة”، جمهورية كوريا (H16C2177، H18C1178).
Materials
| Adenine | Sigma | A2786 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| AggreWell Medium (EB formation medium) | STEMCELL | 05893 | EB formation |
| Anti-Fibronectin antibody | abcam | ab23750 | Fibroblast marker |
| Anti-KRT14 antibody | abcam | ab7800 | Keratinocyte marker |
| Anti-Loricrin antibody | abcam | ab85679 | Stratum corneum marker |
| Anti-p63 antibody | abcam | ab124762 | Keratinocyte marker |
| Anti-Vimentin antibody | Santa cruz | sc-7558 | Fibroblast marker |
| BAND AID FLEXIBLE FABRIC | Johnson & Johnson | – | Bandage |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | BD | 354277 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| BLACK SILK suture | AILEEE | SK617 | Skin graft |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Collagen type I | BD | 354236 | 3D skin organoid |
| Collagen type IV | Santa-cruz | sc-29010 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Defined keratinocyte-Serum Free Medium | Gibco | 10744-019 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11995065 | Component of differentiation medium |
| DMEM/F12 Medium | Gibco | 11330-032 | Component of differentiation medium |
| Essential 8 medium | Gibco | A1517001 | iPSC medium |
| FBS, Qualified | Corning | 35-015-CV | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Glutamax Supplement | Gibco | 35050061 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Insulin | Invtrogen | 12585-014 | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Iris standard curved scissor | Professional | PC-02.10 | Surgical instrument |
| Keratinocyte Serum Free Medium | Gibco | 17005-042 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| MEM Non-Essential Amino Acid | Gibco | 1140050 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Meriam Forceps Thumb 16 cm | HIROSE | HC 2265-1 | Surgical instrument |
| NOD.CB17-Prkdc SCID/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice strain for skin graft |
| Petri dish 90 mm | Hyundai Micro | H10090 | Plastic ware |
| Recombinant Human BMP-4 | R&D | 314-BP | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Recombinant human EGF protein | R&D | 236-EG | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| T/C Petridish 100 mm, 240/bx | TPP | 93100 | Plastic ware |
| Transferrin | Sigma | T3705 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Transwell-COL collagen-coated membrane inserts | Corning | CLS3492 | Plastic ware for 3D skin organoid |
| Vitronectin | Life technologies | A14700 | iPSC culture |
| Y-27632 Dihydrochloride | peprotech | 1293823 | iPSC culture |
References
- Vincent, J. F., Bogatyreva, O. A., Bogatyrev, N. R., Bowyer, A., Pahl, A. K. Biomimetics: its practice and theory. Journal of The Royal Society Interface. 3 (9), 471-482 (2006).
- Madison, K. C. Barrier function of the skin: “la raison d’etre” of the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 121 (2), 231-241 (2003).
- Chen, M., Przyborowski, M., Berthiaume, F. Stem cells for skin tissue engineering and wound healing. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 37 (4-5), 399-421 (2009).
- Dixit, S., et al. Immunological challenges associated with artificial skin grafts: available solutions and stem cells in future design of synthetic skin. Journal of Biological Engineering. 11, 49 (2017).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10 (6), 678-684 (2012).
- Yamanaka, S. Pluripotency and nuclear reprogramming. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363 (1500), 2079-2087 (2008).
- Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The potential for immunogenicity of autologous induced pluripotent stem cell-derived therapies. Journal of Biological Chemistry. 289 (8), 4571-4577 (2014).
- Zimmermann, A., Preynat-Seauve, O., Tiercy, J. M., Krause, K. H., Villard, J. Haplotype-based banking of human pluripotent stem cells for transplantation: potential and limitations. Stem Cells and Development. 21 (13), 2364-2373 (2012).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Terasaki, P. I. A brief history of HLA. Immunologic Research. 38 (1-3), 139-148 (2007).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Rim, Y. A., et al. Recent progress of national banking project on homozygous HLA-typed induced pluripotent stem cells in South Korea. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 1531-1536 (2018).
- Nakatsuji, N., Nakajima, F., Tokunaga, K. HLA-haplotype banking and iPS cells. Nature Biotechnology. 26 (7), 739-740 (2008).
- Pappas, D. J., et al. Proceedings: human leukocyte antigen haplo-homozygous induced pluripotent stem cell haplobank modeled after the california population: evaluating matching in a multiethnic and admixed population. Stem Cells Translational Medicine. 4 (5), 413-418 (2015).
- Embryoid body formation from human pluripotent stem cells in chemically defined E8 media. StemBook Available from: https://www.stembook.org/node/6632 (2008)
- Kim, Y., et al. Establishment of a complex skin structure via layered co-culture of keratinocytes and fibroblasts derived from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 217 (2018).
- Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. The Korean Journal of Internal Medicine. 29 (5), 547-557 (2014).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
- Pham, T. L., Nguyen, T. T., Van Bui, A., Nguyen, M. T., Van Pham, P. Fetal heart extract facilitates the differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into heart muscle precursor cells. Cytotechnology. 68 (4), 645-658 (2016).
- Stecklum, M., et al. Cell differentiation mediated by co-culture of human umbilical cord blood stem cells with murine hepatic cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 51 (2), 183-191 (2015).
- Nam, Y., Rim, Y. A., Ju, J. H. Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (124), e55988 (2017).
- Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Application of Cord Blood and Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells for Cartilage Regeneration. Cell Transplantation. , (2018).
- Shevde, N. K., Mael, A. A. Techniques in embryoid body formation from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 946, 535-546 (2013).
- Shamis, Y., et al. iPSC-derived fibroblasts demonstrate augmented production and assembly of extracellular matrix proteins. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 48 (2), 112-122 (2012).
- Bikle, D. D., Xie, Z., Tu, C. L. Calcium regulation of keratinocyte differentiation. Expert Review of Endocrinology & Metabolism. 7 (4), 461-472 (2012).
- Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. Keratinocytes grown at the air-liquid interface. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 22 (12), 695-705 (1986).
- Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. Journal of Investigative Dermatology. 81, 28-33 (1983).
- Steven, A. C., Bisher, M. E., Roop, D. R., Steinert, P. M. Biosynthetic pathways of filaggrin and loricrin–two major proteins expressed by terminally differentiated epidermal keratinocytes. Journal of Structural Biology. 104 (1-3), 150-162 (1990).
- Hohl, D., et al. Characterization of human loricrin. Structure and function of a new class of epidermal cell envelope proteins. Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6626-6636 (1991).
- Bern, R., et al. Original and modified technique of tie-over dressing: Method and application in burn patients. Burns. 44 (5), 1357-1360 (2018).
- Joyce, C. W., Joyce, K. M., Kennedy, A. M., Kelly, J. L. The Running Barbed Tie-over Dressing. Plastic and Reconstructive Surgery – Global Open. 2 (4), 137 (2014).
- Wang, C. K., Nelson, C. F., Brinkman, A. M., Miller, A. C., Hoeffler, W. K. Spontaneous cell sorting of fibroblasts and keratinocytes creates an organotypic human skin equivalent. Journal of Investigative Dermatology. 114 (4), 674-680 (2000).
- Yang, R., et al. Generation of folliculogenic human epithelial stem cells from induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 5, 3071 (2014).
