Generación de 3D piel organoide de cable derivadas de sangre inducida por las células de vástago Pluripotent
Summary
Proponemos un protocolo que muestra cómo distinguir keratinocytes derivados de células madre pluripotentes inducidas y fibroblastos y generar un organoide de piel 3D, usando estos queratinocitos y fibroblastos. Este protocolo contiene un paso adicional de generar un modelo de ratones humanizados. La técnica presentada aquí mejorará la investigación dermatológica.
Abstract
La piel es el órgano más grande del cuerpo y tiene muchas funciones. La piel actúa como barrera física y protector del cuerpo y regula las funciones corporales. Biomimética es la imitación de los modelos, sistemas y elementos de la naturaleza con el fin de resolver problemas humanos complejos1. Biomimética de la piel es una herramienta útil para la medicina regenerativa in vivo y in vitro investigación. Las células madre humanas pluripotentes inducidas (iPSCs) tienen la característica de la proliferación ilimitada y la capacidad de diferenciación de tres capas germinales. IPSCs humanos se generan de varias células primarias, como las células sanguíneas, queratinocitos, fibroblastos y más. Entre ellos, células mononucleares de sangre de cordón (CBMCs) han emergido como una fuente alternativa de la célula desde la perspectiva de la medicina regenerativa allogeneic. CBMCs son útiles en medicina regenerativa porque leucocito humano antígeno (HLA) escribir es esencial para la célula del sistema bancario. Nos proporcionan un método para la diferenciación de CBMC-iPSCs en queratinocitos y los fibroblastos y para la generación de un organoide de piel 3D. Fibroblastos y queratinocitos derivados de iPSC CBMC tienen características similares a una línea celular primaria. Los organoides de la piel 3D se generan superponiendo una capa epidérmica en una capa dérmica. Mediante el trasplante de este organoide 3D de la piel, se genera un modelo de ratones humanizados. Este estudio demuestra que un organoide de piel derivado de iPSC humana 3D puede ser una herramienta novedosa, la alternativa para la investigación dermatológica in vitro e in vivo.
Introduction
La piel cubre la superficie exterior del cuerpo y protege órganos internos. La piel tiene varias funciones, incluyendo la protección contra patógenos, absorber y almacenar agua, regular la temperatura del cuerpo y excretar el cuerpo de residuos2. Injertos de piel se pueden clasificar dependiendo de la fuente de la piel; injertos con piel de otro donante se denominan aloinjertos e injertos utilizando la piel del propio paciente son autoinjertos. Aunque un autoinjerto es el tratamiento preferido debido a su riesgo de rechazo baja, biopsias de la piel son difíciles de realizar en pacientes con lesiones severas o un número insuficiente de células de la piel. En pacientes con quemaduras graves, tres veces el número de células de la piel es necesario para cubrir áreas grandes. La disponibilidad limitada de las células de la piel del cuerpo del paciente los resultados en situaciones donde es necesario allogenous trasplante. Un aloinjerto se utiliza temporalmente hasta que el trasplante autólogo puede realizarse ya que generalmente es rechazado por el sistema de inmune después de aproximadamente 1 semana3. Para superar el rechazo por el sistema inmune del paciente, injertos deben venir de una fuente con la misma identidad inmunológica del paciente4.
IPSCs humanas son una fuente emergente de células para la terapia de la célula de vástago5. IPSCs humanas se generan en las células somáticas, utilizando factores de reprogramación como OCT4, SOX2, Klf4 y c-Myc6. Utilizando iPSCs humana supera los problemas éticos e inmunológicos de las células madre embrionarias (ESCs)7,8. Humanos iPSCs con pluripotencia y puede diferenciarse en tres capas germinales9. La presencia de HLA, un factor crítico en medicina regenerativa, determina la respuesta inmune y la posibilidad de rechazo10. El uso de derivados del paciente iPSCs resuelve los problemas de rechazo de la limitación y el sistema inmune celular-fuente. CBMCs también han surgido como una fuente alternativa de la célula para medicina regenerativa11. Obligatorio HLA mecanografía, que ocurre durante la banca CBMC, se puede utilizar fácilmente para la investigación y trasplante. Además, homocigótica tipo HLA iPSCs puede aplicar ampliamente a varios pacientes12. Un banco de CBMC-iPSC es un novedoso y eficaz estrategia para terapia celular y medicina regenerativa alógeno12,13,14. En este estudio, utilizamos CBMC-iPSCs, diferenciado en queratinocitos y fibroblastos y generar capas 3D estratificado de la piel. Los resultados de este estudio sugieren que un organoide 3D CBMC-iPSC-derivados de la piel es una novedosa herramienta para la investigación dermatológica in vitro e in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
IPSCs humanas se han sugerido como una nueva alternativa para la medicina regenerativa personalizada17. Derivados del paciente personalizados iPSCs reflejan características de los pacientes que pueden utilizarse para el modelado de enfermedades, detección de drogas y trasplante autólogo18,19. El uso de iPSCs derivados del paciente también puede superar problemas con respecto a células primarias, la falta de un número adecuado de cél…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Corea salud tecnología R & D proyectos, Ministerio de sanidad, bienestar y familia, República de Corea (H16C2177, H18C1178).
Materials
| Adenine | Sigma | A2786 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| AggreWell Medium (EB formation medium) | STEMCELL | 05893 | EB formation |
| Anti-Fibronectin antibody | abcam | ab23750 | Fibroblast marker |
| Anti-KRT14 antibody | abcam | ab7800 | Keratinocyte marker |
| Anti-Loricrin antibody | abcam | ab85679 | Stratum corneum marker |
| Anti-p63 antibody | abcam | ab124762 | Keratinocyte marker |
| Anti-Vimentin antibody | Santa cruz | sc-7558 | Fibroblast marker |
| BAND AID FLEXIBLE FABRIC | Johnson & Johnson | – | Bandage |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | BD | 354277 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| BLACK SILK suture | AILEEE | SK617 | Skin graft |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Collagen type I | BD | 354236 | 3D skin organoid |
| Collagen type IV | Santa-cruz | sc-29010 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Defined keratinocyte-Serum Free Medium | Gibco | 10744-019 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11995065 | Component of differentiation medium |
| DMEM/F12 Medium | Gibco | 11330-032 | Component of differentiation medium |
| Essential 8 medium | Gibco | A1517001 | iPSC medium |
| FBS, Qualified | Corning | 35-015-CV | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Glutamax Supplement | Gibco | 35050061 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Insulin | Invtrogen | 12585-014 | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Iris standard curved scissor | Professional | PC-02.10 | Surgical instrument |
| Keratinocyte Serum Free Medium | Gibco | 17005-042 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| MEM Non-Essential Amino Acid | Gibco | 1140050 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Meriam Forceps Thumb 16 cm | HIROSE | HC 2265-1 | Surgical instrument |
| NOD.CB17-Prkdc SCID/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice strain for skin graft |
| Petri dish 90 mm | Hyundai Micro | H10090 | Plastic ware |
| Recombinant Human BMP-4 | R&D | 314-BP | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Recombinant human EGF protein | R&D | 236-EG | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| T/C Petridish 100 mm, 240/bx | TPP | 93100 | Plastic ware |
| Transferrin | Sigma | T3705 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Transwell-COL collagen-coated membrane inserts | Corning | CLS3492 | Plastic ware for 3D skin organoid |
| Vitronectin | Life technologies | A14700 | iPSC culture |
| Y-27632 Dihydrochloride | peprotech | 1293823 | iPSC culture |
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