Geração de organoides pele 3D do cordão hemoderivados induzida por células-tronco pluripotentes
Summary
Propomos um protocolo que mostra como diferenciar pluripotentes induzidas células-tronco derivadas de queratinócitos e fibroblastos e gerar uma pele 3D organoides, usando estes queratinócitos e fibroblastos. Este protocolo contém uma etapa adicional de gerar um modelo de ratos humanizados. A técnica aqui apresentada vai melhorar pesquisa dermatológica.
Abstract
A pele é o maior órgão do corpo e tem muitas funções. A pele atua como uma barreira física e protetor do corpo e regula as funções corporais. A biomimética é a imitação dos modelos, sistemas e elementos da natureza com a finalidade de resolver problemas humanos complexos1. Pele a biomimética é uma ferramenta útil para investigação de doença in vitro e in vivo medicina regenerativa. Células-tronco humanas pluripotentes induzidas (iPSCs) têm a característica de proliferação ilimitada e a capacidade de diferenciação de três camadas germinativas. IPSCs humanas são gerados a partir de várias células primárias, tais como as células do sangue, queratinócitos, fibroblastos e muito mais. Entre eles, células mononucleares de sangue de cordão (CBMCs) surgiram como uma fonte alternativa de célula na perspectiva da medicina regenerativa alogênico. CBMCs são úteis na medicina regenerativa, porque leucocitário humano (HLA) de antígeno digitando é essencial para a célula, sistema bancário. Nós fornecemos um método para a diferenciação de CBMC-iPSCs em queratinócitos e fibroblastos e para a geração de uma pele 3D organoides. Fibroblastos e queratinócitos CBMC-iPSC derivados têm características semelhantes a uma linha celular primária. Os organoids 3D da pele são gerados pela sobreposição de uma camada epidérmica em uma camada dérmica. Transplantando essa pele 3D organoides, é gerado um modelo de ratos humanizados. Este estudo mostra que um organoides 3D pele humana iPSC-derivado podem ser uma ferramenta de novela, alternativa para pesquisa dermatológica in vitro e in vivo.
Introduction
Pele cobre a superfície mais externa do corpo e protege os órgãos internos. A pele tem várias funções, incluindo proteção contra patógenos, absorver e armazenar água, regular a temperatura do corpo e excretando corpo perca2. Enxertos de pele podem ser classificados dependendo da fonte de pele; enxertos de pele de outro doador são denominados aloenxertos, e enxertos usando a pele do próprio paciente são autoenxertos. Embora um autograft é o tratamento preferido devido ao seu risco de rejeição baixa, biópsias de pele são difíceis de serem realizadas em pacientes com lesões graves ou um número insuficiente de células da pele. Em pacientes com queimaduras graves, três vezes o número de células da pele é necessário para cobrir grandes áreas. A disponibilidade limitada de células da pele do corpo do paciente resulta em situações em que o transplante de allogenous é necessário. Um aloenxerto é usado temporariamente até transplante autólogo pode ser realizado desde que geralmente é rejeitada pelo sistema imunológico do hospedeiro após aproximadamente 1 semana3. Para superar a rejeição pelo sistema imunológico do paciente, enxertos devem ser provenientes de uma fonte com a mesma identidade imunológica do paciente4.
IPSCs humanas são uma fonte emergente das células para terapia de células-tronco5. IPSCs humanas são gerados a partir de células somáticas, usando reprogramação fatores como OCT4, SOX2, Klf4 e c-Myc6. Usar iPSCs humana supera as questões éticas e imunológicas das células-tronco embrionárias (CES)7,8. IPSCs humanas ter pluripotência e pode diferenciar-se em três camadas germinativas9. A presença de HLA, um fator crítico na medicina regenerativa, determina a resposta imune e a possibilidade de rejeição10. O uso de derivados de paciente iPSCs resolve os problemas de rejeição de limitação e sistema imunológico de células-fonte. CBMCs também têm surgido como uma fonte alternativa de célula para medicina regenerativa11. HLA obrigatório digitar, que ocorre durante a operação bancária CBMC, facilmente pode ser usado para pesquisa e transplante de órgãos. Além disso, homozigotos HLA-tipo iPSCs pode aplicar amplamente vários pacientes12. Um banco CBMC-iPSC é uma estratégia eficiente para terapia celular e medicina regenerativa alogênico12,13,14e romance. Neste estudo, utilizamos CBMC-iPSCs, diferenciadas em queratinócitos e fibroblastos e gerar camadas estratificadas pele 3D. Os resultados deste estudo sugerem que um organoides CBMC-iPSC-derivado de pele 3D é uma nova ferramenta de pesquisa dermatológica in vitro e in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
IPSCs humanas têm sido sugeridos como uma nova alternativa para a medicina regenerativa personalizada17. IPSCs personalizados derivado de paciente refletem características de paciente que podem ser usadas para modelagem de doença, triagem de drogas e transplante autólogo18,19. O uso de derivados de paciente iPSCs também pode superar problemas relativos as células primárias, a falta de números de celular adequada e reações imunes<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por um subsídio da Coreia saúde tecnologia R & D projeto, Ministério da saúde, bem-estar e assuntos de família, República da Coreia (H16C2177, H18C1178).
Materials
| Adenine | Sigma | A2786 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| AggreWell Medium (EB formation medium) | STEMCELL | 05893 | EB formation |
| Anti-Fibronectin antibody | abcam | ab23750 | Fibroblast marker |
| Anti-KRT14 antibody | abcam | ab7800 | Keratinocyte marker |
| Anti-Loricrin antibody | abcam | ab85679 | Stratum corneum marker |
| Anti-p63 antibody | abcam | ab124762 | Keratinocyte marker |
| Anti-Vimentin antibody | Santa cruz | sc-7558 | Fibroblast marker |
| BAND AID FLEXIBLE FABRIC | Johnson & Johnson | – | Bandage |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | BD | 354277 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| BLACK SILK suture | AILEEE | SK617 | Skin graft |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Collagen type I | BD | 354236 | 3D skin organoid |
| Collagen type IV | Santa-cruz | sc-29010 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Defined keratinocyte-Serum Free Medium | Gibco | 10744-019 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11995065 | Component of differentiation medium |
| DMEM/F12 Medium | Gibco | 11330-032 | Component of differentiation medium |
| Essential 8 medium | Gibco | A1517001 | iPSC medium |
| FBS, Qualified | Corning | 35-015-CV | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Glutamax Supplement | Gibco | 35050061 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Insulin | Invtrogen | 12585-014 | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Iris standard curved scissor | Professional | PC-02.10 | Surgical instrument |
| Keratinocyte Serum Free Medium | Gibco | 17005-042 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| MEM Non-Essential Amino Acid | Gibco | 1140050 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Meriam Forceps Thumb 16 cm | HIROSE | HC 2265-1 | Surgical instrument |
| NOD.CB17-Prkdc SCID/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice strain for skin graft |
| Petri dish 90 mm | Hyundai Micro | H10090 | Plastic ware |
| Recombinant Human BMP-4 | R&D | 314-BP | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Recombinant human EGF protein | R&D | 236-EG | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| T/C Petridish 100 mm, 240/bx | TPP | 93100 | Plastic ware |
| Transferrin | Sigma | T3705 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Transwell-COL collagen-coated membrane inserts | Corning | CLS3492 | Plastic ware for 3D skin organoid |
| Vitronectin | Life technologies | A14700 | iPSC culture |
| Y-27632 Dihydrochloride | peprotech | 1293823 | iPSC culture |
References
- Vincent, J. F., Bogatyreva, O. A., Bogatyrev, N. R., Bowyer, A., Pahl, A. K. Biomimetics: its practice and theory. Journal of The Royal Society Interface. 3 (9), 471-482 (2006).
- Madison, K. C. Barrier function of the skin: “la raison d’etre” of the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 121 (2), 231-241 (2003).
- Chen, M., Przyborowski, M., Berthiaume, F. Stem cells for skin tissue engineering and wound healing. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 37 (4-5), 399-421 (2009).
- Dixit, S., et al. Immunological challenges associated with artificial skin grafts: available solutions and stem cells in future design of synthetic skin. Journal of Biological Engineering. 11, 49 (2017).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10 (6), 678-684 (2012).
- Yamanaka, S. Pluripotency and nuclear reprogramming. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363 (1500), 2079-2087 (2008).
- Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The potential for immunogenicity of autologous induced pluripotent stem cell-derived therapies. Journal of Biological Chemistry. 289 (8), 4571-4577 (2014).
- Zimmermann, A., Preynat-Seauve, O., Tiercy, J. M., Krause, K. H., Villard, J. Haplotype-based banking of human pluripotent stem cells for transplantation: potential and limitations. Stem Cells and Development. 21 (13), 2364-2373 (2012).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Terasaki, P. I. A brief history of HLA. Immunologic Research. 38 (1-3), 139-148 (2007).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Rim, Y. A., et al. Recent progress of national banking project on homozygous HLA-typed induced pluripotent stem cells in South Korea. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 1531-1536 (2018).
- Nakatsuji, N., Nakajima, F., Tokunaga, K. HLA-haplotype banking and iPS cells. Nature Biotechnology. 26 (7), 739-740 (2008).
- Pappas, D. J., et al. Proceedings: human leukocyte antigen haplo-homozygous induced pluripotent stem cell haplobank modeled after the california population: evaluating matching in a multiethnic and admixed population. Stem Cells Translational Medicine. 4 (5), 413-418 (2015).
- Embryoid body formation from human pluripotent stem cells in chemically defined E8 media. StemBook Available from: https://www.stembook.org/node/6632 (2008)
- Kim, Y., et al. Establishment of a complex skin structure via layered co-culture of keratinocytes and fibroblasts derived from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 217 (2018).
- Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. The Korean Journal of Internal Medicine. 29 (5), 547-557 (2014).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
- Pham, T. L., Nguyen, T. T., Van Bui, A., Nguyen, M. T., Van Pham, P. Fetal heart extract facilitates the differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into heart muscle precursor cells. Cytotechnology. 68 (4), 645-658 (2016).
- Stecklum, M., et al. Cell differentiation mediated by co-culture of human umbilical cord blood stem cells with murine hepatic cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 51 (2), 183-191 (2015).
- Nam, Y., Rim, Y. A., Ju, J. H. Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (124), e55988 (2017).
- Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Application of Cord Blood and Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells for Cartilage Regeneration. Cell Transplantation. , (2018).
- Shevde, N. K., Mael, A. A. Techniques in embryoid body formation from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 946, 535-546 (2013).
- Shamis, Y., et al. iPSC-derived fibroblasts demonstrate augmented production and assembly of extracellular matrix proteins. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 48 (2), 112-122 (2012).
- Bikle, D. D., Xie, Z., Tu, C. L. Calcium regulation of keratinocyte differentiation. Expert Review of Endocrinology & Metabolism. 7 (4), 461-472 (2012).
- Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. Keratinocytes grown at the air-liquid interface. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 22 (12), 695-705 (1986).
- Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. Journal of Investigative Dermatology. 81, 28-33 (1983).
- Steven, A. C., Bisher, M. E., Roop, D. R., Steinert, P. M. Biosynthetic pathways of filaggrin and loricrin–two major proteins expressed by terminally differentiated epidermal keratinocytes. Journal of Structural Biology. 104 (1-3), 150-162 (1990).
- Hohl, D., et al. Characterization of human loricrin. Structure and function of a new class of epidermal cell envelope proteins. Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6626-6636 (1991).
- Bern, R., et al. Original and modified technique of tie-over dressing: Method and application in burn patients. Burns. 44 (5), 1357-1360 (2018).
- Joyce, C. W., Joyce, K. M., Kennedy, A. M., Kelly, J. L. The Running Barbed Tie-over Dressing. Plastic and Reconstructive Surgery – Global Open. 2 (4), 137 (2014).
- Wang, C. K., Nelson, C. F., Brinkman, A. M., Miller, A. C., Hoeffler, W. K. Spontaneous cell sorting of fibroblasts and keratinocytes creates an organotypic human skin equivalent. Journal of Investigative Dermatology. 114 (4), 674-680 (2000).
- Yang, R., et al. Generation of folliculogenic human epithelial stem cells from induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 5, 3071 (2014).
