Generation von 3D Haut organoide aus Cord Blood-abgeleitete induzierte pluripotente Stammzellen
Summary
Wir schlagen eine Protokoll, die zeigt, wie man differenzieren induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Keratinozyten und Fibroblasten und generieren eine organoide 3D Haut mit diesen Keratinozyten und Fibroblasten. Dieses Protokoll enthält einen zusätzlichen Schritt einem humanisierten Mäuse-Modell zu erzeugen. Die hier vorgestellten Technik verbessert die dermatologische Forschung.
Abstract
Die Haut ist das größte Organ und hat viele Funktionen. Die Haut wirkt wie eine physikalische Barriere und Beschützer des Körpers und reguliert Körperfunktionen. Bionik ist die Nachahmung der Modelle, Systeme und Elemente der Natur zur Lösung komplexer Probleme1. Haut-Bionik ist ein nützliches Werkzeug für die Erforschung von Krankheiten in-vitro- und in-vivo regenerative Medizin. Menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) haben das Merkmal der unbegrenzten Verbreitung und die Fähigkeit der Differenzierung, drei Mikrobeschichten. Menschlichen iPSCs entstehen aus verschiedenen Primärzellen, wie Blutzellen, Keratinozyten und Fibroblasten. Unter ihnen sind Kabel mononukleären Blutzellen (CBMCs) als alternative Zelle Quelle aus der Perspektive der allogenen regenerative Medizin entstanden. CBMCs eignen sich in der regenerativen Medizin, weil human Leukocyte Antigen (HLA) Eingabe in die Zelle, die banking-System notwendig ist. Wir bieten eine Methode für die Differenzierung von CBMC iPSCs in Keratinozyten und Fibroblasten und zur Erzeugung von einem 3D Haut organoide. CBMC-iPSC-derived Keratinozyten und Fibroblasten haben ähnliche Merkmale auf, eine primäre Zelllinie. Die 3D Haut Organellen entstehen durch die Überlagerung einer epidermalen Schicht auf eine Hautschicht. Durch die Transplantation von diesem 3D Haut organoide, wird einen vermenschlichten Mäuse-Modell erstellt. Diese Studie zeigt, dass ein 3D iPSC-abgeleitete Menschenhaut organoide möglicherweise eine neuartige, alternative Tool für dermatologische Forschung in vitro und in vivo.
Introduction
Haut bedeckt die äußerste Oberfläche des Körpers und schützt innere Organe. Die Haut hat verschiedene Funktionen, einschließlich Schutz gegen Krankheitserreger, Aufnahme und Speicherung von Wasser, Regulierung der Körpertemperatur, und Körper Ausscheiden Abfälle2. Hauttransplantationen können je nach Haut Quelle eingestuft werden; Transplantate mit der Haut von einem anderen Spender sind Allografts bezeichnet, und mit der Haut des Patienten Transplantate sind Autotransplantate. Obwohl eine Autotransplantation die bevorzugte Behandlung wegen seiner niedrigen Ablehnung ist, sind Hautbiopsien schwer auf Patienten mit schweren Verletzungen oder eine unzureichende Anzahl von Hautzellen durchführen. Bei Patienten mit schweren Verbrennungen sind drei Mal die Zahl der Hautzellen notwendig, um große Flächen abdecken. Die begrenzte Verfügbarkeit von Hautzellen vom Körper des Patienten führt zu Situationen, wo allo-Transplantation erforderlich ist. Ein Allograft dient vorübergehend bis autologe Transplantation durchgeführt werden kann, da es in der Regel vom Immunsystem des Wirts nach ca. 1 Woche3abgelehnt wird. Ablehnung durch das Immunsystem zu überwinden, müssen die Transplantate aus einer Quelle mit der gleichen immun Identität als Patient4kommen.
Menschlichen iPSCs sind eine neue Quelle von Zellen für Stammzell-Therapie5. Menschlichen iPSCs entstehen aus Körperzellen, Neuprogrammierung Faktoren wie OCT4, SOX2, Klf4 und c-Myc-6. Mit menschlichen iPSCs überwindet die ethischen und immunologischen Fragen von embryonalen Stammzellen (WSR)7,8. Menschlichen iPSCs haben Pluripotenz und kann in drei Mikrobeschichten9unterscheiden. Das Vorhandensein von HLA, ein entscheidender Faktor in der regenerativen Medizin, bestimmt die Immunantwort und die Möglichkeit der Ablehnung10. Die Verwendung von Patienten abgeleitet iPSCs löst die Probleme der Zelle-Source Einschränkung und Immunsystem Ablehnung. CBMCs sind auch als alternative Zelle Quelle für regenerative Medizin11entstanden. Obligatorische HLA Typisierung, die während CBMC Banking auftritt, kann leicht für Forschung und Transplantation verwendet werden. Weitere, homozygot HLA-Typ iPSCs können weitgehend auf verschiedenen Patienten12anwenden. Eine CBMC iPSC-Bank ist eine neuartige und effiziente Strategie für Zelltherapie und allogenen regenerative Medizin12,13,14. In dieser Studie wir verwenden CBMC-iPSCs in Keratinozyten und Fibroblasten, differenzieren und geschichteten 3D Hautschichten zu generieren. Ergebnisse dieser Studie legen nahe, dass eine CBMC iPSC abgeleitete 3D Haut organoide ein neuartiges Werkzeug für in-vitro- und in-vivo dermatologische Forschung ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Menschlichen iPSCs haben als eine neue Alternative für personalisierte regenerative Medizin17vorgeschlagen worden. Personalisierte iPSCs Patienten abgeleitet reflektieren Patienten-Charakteristika, die für die Krankheit Modellierung, Drogen-Screening und autologe Transplantation18,19verwendet werden können. Die Verwendung von Patienten abgeleitet iPSCs kann auch Probleme in Bezug auf primäre Zellen, ein Mangel an ausreichenden Zellzahl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus Korea Healthcare Technology R & D Projekt, Ministerium für Gesundheit, Wohlfahrt und Familienangelegenheiten, Republik Korea (H16C2177, H18C1178) unterstützt.
Materials
| Adenine | Sigma | A2786 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| AggreWell Medium (EB formation medium) | STEMCELL | 05893 | EB formation |
| Anti-Fibronectin antibody | abcam | ab23750 | Fibroblast marker |
| Anti-KRT14 antibody | abcam | ab7800 | Keratinocyte marker |
| Anti-Loricrin antibody | abcam | ab85679 | Stratum corneum marker |
| Anti-p63 antibody | abcam | ab124762 | Keratinocyte marker |
| Anti-Vimentin antibody | Santa cruz | sc-7558 | Fibroblast marker |
| BAND AID FLEXIBLE FABRIC | Johnson & Johnson | – | Bandage |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | BD | 354277 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| BLACK SILK suture | AILEEE | SK617 | Skin graft |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Collagen type I | BD | 354236 | 3D skin organoid |
| Collagen type IV | Santa-cruz | sc-29010 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Defined keratinocyte-Serum Free Medium | Gibco | 10744-019 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11995065 | Component of differentiation medium |
| DMEM/F12 Medium | Gibco | 11330-032 | Component of differentiation medium |
| Essential 8 medium | Gibco | A1517001 | iPSC medium |
| FBS, Qualified | Corning | 35-015-CV | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Glutamax Supplement | Gibco | 35050061 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Insulin | Invtrogen | 12585-014 | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Iris standard curved scissor | Professional | PC-02.10 | Surgical instrument |
| Keratinocyte Serum Free Medium | Gibco | 17005-042 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| MEM Non-Essential Amino Acid | Gibco | 1140050 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Meriam Forceps Thumb 16 cm | HIROSE | HC 2265-1 | Surgical instrument |
| NOD.CB17-Prkdc SCID/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice strain for skin graft |
| Petri dish 90 mm | Hyundai Micro | H10090 | Plastic ware |
| Recombinant Human BMP-4 | R&D | 314-BP | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Recombinant human EGF protein | R&D | 236-EG | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| T/C Petridish 100 mm, 240/bx | TPP | 93100 | Plastic ware |
| Transferrin | Sigma | T3705 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Transwell-COL collagen-coated membrane inserts | Corning | CLS3492 | Plastic ware for 3D skin organoid |
| Vitronectin | Life technologies | A14700 | iPSC culture |
| Y-27632 Dihydrochloride | peprotech | 1293823 | iPSC culture |
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