Отдельные лист ассы для упрощения исследования экспрессии генов в картофель во время заражения жевательного насекомого Manduca sexta
Summary
Представленный метод создает естественные травоядные поврежденные ткани растений путем применения личинок Manduca sexta к отдельным листьям картофеля. Ткань завода is assayed для выражения 6 homologs фактора транскрипции, включинных в предыдущих реакциях к травоядной насекомой.
Abstract
Мультитрофический характер исследований экспрессии генов травоядных насекомых требует большого количества биологических репликаций, создавая потребность в более простых, более рационализированных протоколах травоядных. Возмущения жевательных насекомых обычно изучаются в целых растительных системах. Хотя вся эта стратегия организма популярна, нет необходимости, если подобные наблюдения могут быть воспроизведены в одном отдельном листе. Предполагается, что основные элементы, необходимые для трансдукции сигнала, присутствуют в самом листе. В случае ранних событий в трансдукции сигнала, клетки должны только получать сигнал от возмущения и передавать этот сигнал соседним клеткам, которые анализируются на экспрессию генов.
Предлагаемый метод просто меняет сроки отсоединения. В целых экспериментах завода личинки ограничиваются одним листом, который в конечном итоге отделяется от растения и прослеживаются на экспрессию генов. Если порядок иссечения обращен вспять, от последнего в цельных исследованиях растений, до первого в отдельном исследовании, эксперимент по кормлению упрощается.
Solanum tuberosum var. Kennebec распространяется узловой передачи в простой среде культуры тканей и передается в почву для дальнейшего роста при желании. Листья вырезаются из родительского растения и перемещаются в петри блюда, где кормление проводится с личинок этапов M. sexta. Поврежденная ткань листьев анализируется для выражения относительно ранних событий в трансдукции сигнала. Анализ экспрессии гена определил факторы транскрипции Cys2-His2 (C2H2), подтверждающие успех использования отдельных листьев в ранних исследованиях. Метод легче выполнять, чем целые заражения растений и использует меньше места.
Introduction
Травоядный набор в движение ряд молекулярных событий, в ходе которых растение может как определить нападение и смонтировать соответствующий ответ для его выживания. Растение получает два основных сигнала от жевательных насекомых; один из физических повреждений тканей, а другой от насекомых конкретных веществ. Повреждение связанных молекулярных моделей (DAMPs) высвобождаются в ответ на повреждение, созданное личинки ротовых рта и вызвать четко определенные реакции раны, что приводит к увеличению гормона жасмоновой кислоты и транскрипции защитных генов1. Одним из самых известных DAMPs является systemin, полипептид, который образуется в результате расщепления большего белка просистемина после того, как лист ранен2,3. Реакция раны жасмониной кислоты дополнительно модулируется травоядными молекулярными паттернами (HAMPs), которые могут быть получены из слюны гусеницы, содержимого кишечника (регургитант) и кала (frass)4. Насекомые используют эти вещества, чтобы либо повысить или уклониться от обороны ответ5. Транскрипционные факторы затем ретранслировать сообщение от гормональныхсигналов в защите ответ через регулирование вниз по течению обороны генов 6,7,8.
Некоторые исследования взаимодействия растительного и насекомого, используемые в лабораторных условиях, имеют смоделированный тип, с целью приближения естественного метода кормления насекомым. Имитация травоядной травы, как правило, достигается путем создания искусственного повреждения тканей растений с различными инструментами, которые имитируют конкретный механизм насекомых рот достаточно, чтобы вызвать выпуск DAMPs и вызвать производство оборонных генов. Другие насекомые конкретных компонентов, таких как устные выделения или регургитант часто добавляются, чтобы повторить вклад от HAMPs9,10,11. Создание определенного размера и типа раны и применение точных количеств ГАМК является одним из преимуществ такого рода исследований и может предложить более воспроизводимые результаты. Естественные исследования травости, где повреждение ткани растений достигается путем применения полевых или лабораторно-воспитанных насекомых, часто являются более сложными, потому что размер раны и hamP суммы регулируются поведением насекомых и добавить изменчивость Данных. Естественные против смоделированных методов и их преимущества и недостатки хорошо обсуждаются в литературе12,13,14.
Для изучения ранних сигнальных событий, таких как транскрипционные факторы, определенный процент листа необходимо потреблять в относительно короткий промежуток времени, поэтому личинки должны начать жевать немедленно и поддерживать потребление, пока лист не заморожен для анализа. M. sexta является ненасытной подачи на нескольких solanaceous растений во многих из его личинок этапов, что делает его идеальным для придавая максимальный ущерб в относительно короткий промежуток времени15. Это удобно при изучении ранних сигнальных событий, так как реакция растения происходит почти сразу после того, как насекомое контактирует с поверхностью листа16,17. Широко используемый метод клетки зажима сдерживания доказывает неуклюже, по мере того как множественные клетки потребовали бы постоянн регулировки в течении эксперимента для того чтобы позволить для удаления или добавления личинок. Листья также должны быть достаточно большими и достаточно сильными, чтобы поддерживать несколько насекомых кормления в то же время. Эти виды картофельных растений требуют большого количества места для наблюдения за кормлением. Larvae часто перемещается в нижней части поверхности листьев, что также делает кормления наблюдений довольно трудно. Использование целых растений для выполнения этих экспериментов является явно громоздким.
В настоящем исследовании используются отдельные листья, изолированные в чашках Петри, а не целые растения, чтобы упорядочить и упростить весь подход к изучению травоядной травы. Применение протокола в данном исследовании ограничивается наблюдением группы факторов транскрипции C2H2, индуцированных в начале картофельных листьев после травоядного повреждения личинками M. sexta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Использование существующих целых методов травоядной травы растений не нужно для достижения цели данного конкретного исследования (т.е. экран набор генов-кандидатов для их реакции на заражение). Очевидным преимуществом обособленного уточнения листьев является сокращение времени, нео?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Боба Фаррара и Алексиса Парка за предоставление насекомых, используемых в этом исследовании, и за их опыт в личиночной постановке. Дополнительная благодарность Майклу Блэкберну и Сайкат Гош за критический обзор рукописи.
Упоминание торговых наименований или коммерческих продуктов в данной публикации предназначено исключительно для предоставления конкретной информации и не подразумевает рекомендации или одобрения Со стороны Министерства сельского хозяйства США.
Министерство сельского хозяйства США является поставщиком равных возможностей и работодателем.
Materials
| agar substitute | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | product is Gelzan |
| containment vessel (6,12 or 24 well dish) | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | many other companies sell these products |
| manduca eggs | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30-50 eggs |
| manduca eggs | Great Lakes Hornworm | NA | 50, 100, 250 or 500 eggs |
| manduca larvae | Carolina Biological Supply Company | call for specific larval instar requests | any instar |
| manduca larvae | Great Lakes Hornworm | call for specific larval instar requests | any instar |
| microcentrifuge tubes, 1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | these have been tested in liquid N2 and will not explode |
| Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins | PhytoTechnology Laboratories | M519 | used to make propagation medium |
| nutrient agar mix | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan |
| paper filter discs | Fisher Scientific | 09-805A | Whatman circles-purchase to fit in petri dish |
| petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A or FB0875712 | purchase size appropriate for leaf size |
| potato tubers | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| pots, 10" | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| preservative/biocide | Plant Cell Technology | NA | product is PPM (Plant Preservative Mixture) |
| seed potatoes for explant source | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| slow release fertilizer (14-14-14 ) | any | NA | Osmocote is a popular brand name |
| soft touch forceps | BioQuip | 4750 | |
| soil mix | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | product is Sunshine LC1 mix |
| sterile culture vessel | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Magenta-type vessel, PTL-100 |
| sterile culture vessel | Fisher Scientific | ICN2672206 | product is MP Biomedicals Plantcon |
References
- Choi, H. W., Klessig, D. F. DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity. BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).
- Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins. Science. 253, 895-897 (1991).
- Savatin, D. V., Gramegna, G., Modesti, V., Cervone, F. Wounding in the plant tissue: the defense of a dangerous passage. Frontiers in Plant Science. 470 (5), 1-11 (2014).
- Basu, S., Varsanit, S., Louis, J. Altering Plant Defenses: Herbivore-Associated Molecular Patterns and Effector Arsenal of Chewing Herbivores. Molecular Plant-Microbe Interactions. 31, 13-21 (2018).
- Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110, 15728-15733 (2013).
- Chen, M. -. S. Inducible direct plant defense against insect herbivores: A review. Insect Science. 15, 101-114 (2008).
- Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in jasmonate signaling for multistress resilience. Annual Review of Plant Biology. 69, 387-415 (2018).
- War, A. R., et al. Plant defence against herbivory and insect adaptations. AoB PLANTS. 10 (4), 1-19 (2018).
- McCloud, E. S., Baldwin, I. T. Herbivory and caterpillar regurgitants amplify the wound-induced increases in jasmonic acid but not nicotine in Nicotiana sylvestris. Planta. 203, 430-435 (1997).
- Schittko, U., Hermsmeier, D., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate: II. Accumulation of plant mRNAs responding to insect-derived cues. Plant Physiology. , 701-710 (2001).
- Halitschke, R., Schittko, U., Pohnert, G., Boland, W., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate. III. Fatty acid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient for herbivore-specific plant responses. Plant Physiology. 125, 711-717 (2001).
- Lortzing, T., et al. Transcriptomic responses of Solanum dulcamara to natural and simulated herbivory. Molecular Ecology Resources. 17, 1-16 (2017).
- Hjältén, J. Simulating herbivory: problems and possibilities. Ecological Studies. 173, 243-255 (2004).
- Lehtilä, K., Boalt, E. The use and usefulness of artificial herbivory in plant-herbivore studies. Ecological Studies. 173, 257-275 (2004).
- Schittko, U., Preston, C. A., Baldwin, I. T. Eating the evidence? Manduca sexta larvae can not disrupt specific jasmonate induction in Nicotiana attenuata by rapid consumption. Planta. 210, 343-346 (2000).
- Zebelo, S. A., Maffei, M. E. Role of early signalling events in plant-insect interactions. Journal of Experimental Botany. 66, 435-448 (2015).
- Maffei, M. E., Mithofer, A., Boland, W. Before gene expression: early events in plant-insect interaction. Trends in Plant Science. 12, 310-316 (2007).
- Goodwin, P. B., Adisarwanto, T. Propagation of potato by shoot tip culture in Petri dishes. Potato Research. 23, 445-448 (1980).
- Goodwin, P. B. Rapid propagation of potato by single node cuttings. Field Crops Research. 4, 165-173 (1981).
- Martin, P. A. W., Blackburn, M. B. Using combinatorics to screen Bacillus thuringiensis isolates for toxicity against Manduca sexta and Plutella xylostella. Biological Control. 42, 226-232 (2007).
- Bell, R. A., Joachim, F. G. Techniques for rearing laboratory colonies of tobacco hornworms and pink bollworms. Annals of the Entomological Society of America. 69 (2), 365-373 (1976).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G. The remarkable plethora of infestation-responsive Q-type C2H2 transcription factors in potato. BMC Research Notes. 11, 1-7 (2018).
- Green, J. M., et al. PhenoPhyte: a flexible affordable method to quantify 2D phenotypes from imagery. Plant Methods. 8 (45), 1-12 (2012).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G., Jones, R. W., Farrar, R. R., Blackburn, M. B. Herbivory responsive C2H2 zinc finger transcription factor protein StZFP2 from potato. Plant Physiology and Biochemistry. 80, 226-233 (2014).
- Korth, K. L., Dixon, R. A. Evidence for chewing insect-specific molecular events distinct from a general wound response in leaves. Plant Physiology. 115, 1299-1305 (1997).
- Browne, R. A., Cooke, B. M. Development and evaluation of an in vitro detached leaf assay for pre-screening resistance to Fusarium head blight in wheat. European Journal of Plant Pathology. 110, 91-102 (2004).
- Browne, R. A., et al. Evaluation of components of fusarium head blight resistance in soft red winter wheat germ plasm using a detached leaf assay. Plant Disease. 89, 404-411 (2005).
- Michel, A. P., Rouf Mian, M. A., Davila-Olivas, N. H., Canas, L. A. Detached leaf and whole plant assays for soybean aphid resistance: differential responses among resistance sources and biotypes. Journal of Economic Entomology. 103, 949-957 (2010).
- Sharma, H. C., Pampapathy, G., Dhillon, M. K., Ridsdill-Smith, J. T. Detached leaf assay to screen for host plant resistance to Helicoverpa armigera. Journal of Economic Entomology. 98, 568-576 (2005).
- Vivianne, G. A. A., et al. A laboratory assay for Phytophthora infestans resistance in various Solanum species reflects the field situation. European Journal of Plant Pathology. 105, 241-250 (1999).
- Kamoun, S., et al. A gene encoding a protein elicitor of Phytophthora infestans is down-regulated during infection of potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 10, 13-20 (1997).
- Nowakowska, M., Nowicki, M., Kłosińska, U., Maciorowski, R., Kozik, E. U. Appraisal of artificial screening techniques of tomato to accurately reflect field performance of the Late Blight resistance. Plos One. 9, e109328 (2014).
- Arimura, G., et al. Herbivory-induced volatiles elicit defence genes in lima bean leaves. Nature. 406, 512-515 (2000).
- Erb, M. Volatiles as inducers and suppressors of plant defense and immunity-origins, specificity, perception and signaling. Current Opinion in Plant Biology. 44, 117-121 (2018).
- Hasegawa, S., et al. Gene expression analysis of wounding-induced root-to-shoot communication in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell and Environment. 34, 705-716 (2011).
- Ryan, C. A., Moura, D. S. Systemic wound signaling in plants: A new perception. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 6519-6520 (2002).
- Hilleary, R., Gilroy, S. Systemic signaling in response to wounding and pathogens. Current Opinion in Plant Biology. 43, 57-62 (2018).
- . Hornworms Available from: https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr (2018)
- . Products Available from: https://www.greatlakeshornworm.com/products/ (2018)
- . Raising Manduca sexta Available from: https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html (2018)
- . Teach life cycles with the tobacco hornworm Available from: https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr (2018)
- Chung, S. H., et al. Host plant species determines symbiotic bacterial community mediating suppression of plant defenses. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
