اختبار أوراق منفصلة لتبسيط دراسات التعبير الجيني في البطاطا أثناء الإصابة عن طريق مضغ الحشرات مندوكا sexta
Summary
الطريقة المعروضة يخلق الأنسجة النباتية التالفة الأعشاب الطبيعية من خلال تطبيق يرقات Manduca sexta على أوراق منفصلة من البطاطا. يتم فحص الأنسجة النباتية للتعبير عن ستة متجانسات عامل النسخ المشاركة في الاستجابات المبكرة لعشب الحشرات.
Abstract
الطبيعة المتعددة التغذية لدراسات التعبير الجيني للحشرات الأعشاب العاجية تتطلب أعدادا كبيرة من النسخ البيولوجي، وخلق الحاجة إلى بروتوكولات أكثر بساطة، وأكثر تبسيطا الأعشاب. عادة ما تدرس اضطرابات مضغ الحشرات في النظم النباتية كلها. في حين أن هذه الاستراتيجية الكائن الحي كله تحظى بشعبية، فإنه ليس من الضروري إذا كان يمكن تكرار ملاحظات مماثلة في ورقة منفصلة واحدة. والافتراض هو أن العناصر الأساسية اللازمة لنقل الإشارات موجودة داخل الورقة نفسها. في حالة الأحداث المبكرة في نقل الإشارة، تحتاج الخلايا فقط لتلقي الإشارة من الاضطراب ونقل تلك الإشارة إلى الخلايا المجاورة التي يتم اختبارها للتعبير الجيني.
والطريقة المقترحة تغير ببساطة توقيت المفرزة. في التجارب النباتية الكاملة، تقتصر اليرقات على ورقة واحدة يتم فصلها في نهاية المطاف عن النبات وإسيد هاهية للتعبير الجيني. إذا تم عكس ترتيب الختان، من الماضي في الدراسات النباتية كلها، إلى الأولى في الدراسة المنفصلة، يتم تبسيط تجربة التغذية.
يتم نشر Solanum tuberosum var. Kennebec عن طريق نقل العقدية في وسط زراعة الأنسجة بسيطة ونقلها إلى التربة لمزيد من النمو إذا رغبت في ذلك. يتم استئصال الأوراق من النبات الأم ونقلها إلى أطباق بيتري حيث يتم إجراء فحص التغذية مع مراحل اليرقات من M. sexta. يتم التحقق من تلف الأنسجة الورقية للتعبير عن الأحداث المبكرة نسبيا في نقل إشارة. حدد تحليل التعبير الجيني عوامل النسخ Cys2-His2 (C2H2) الخاصة بالإصابة، مما يؤكد نجاح استخدام الأوراق المنفصلة في دراسات الاستجابة المبكرة. الطريقة هي أسهل لأداء من غزوات النبات كله ويستخدم مساحة أقل.
Introduction
الأعشاب العاج يضع في الحركة سلسلة من الأحداث الجزيئية التي يمكن للنبات على حد سواء تحديد الهجوم وجبل استجابة مناسبة لبقائها. يتلقى النبات اثنين من العظة الأساسية من مضغ الحشرات. واحد من الضرر المادي للأنسجة والآخر من المواد الخاصة بالحشرات. يتم إطلاق الأنماط الجزيئية المرتبطة بالضرر (DAMPs) استجابة للضرر الناجم عن أجزاء الفم اليرقات وإثارة استجابة جرح محددة جيدا ً تؤدي إلى زيادة في حمض الجاسمونيك الهرموني ونسخ جينات الدفاع1. واحدة من DAMPs الأكثر شهرة هو systemin، وهو ببتيد التي يتم تشكيلها من قبل انشقاق أكبر بروتين بروsystemin بعد جرح ورقة2،3. يتم تعديل استجابة الجرح حمض jasmonic كذلك من قبل الأنماط الجزيئية المرتبطة بالأعشاب (HAMPs)، والتي يمكن أن تستمد من اللعاب كاتربيلر، محتويات الأمعاء (regurgitant) والبراز (frass)4. الحشرات استخدام هذه المواد إما لتعزيزأو التهرب من استجابة الدفاع 5. عوامل النسخ ثم نقل الرسالة من إشارات هرمون في استجابة الدفاع عن طريق تنظيم الجينات الدفاع المصب6و7و8.
بعض دراسات التفاعل بين النبات والحشرات المستخدمة في البيئات المختبرية هي من النوع المحاكي ، بهدف تقريب الطريقة الطبيعية للتغذية من قبل الحشرة. عادة ما يتم إنجاز محاكاة الأعشاب العاجعن طريق خلق ضرر اصطناعي للأنسجة النباتية مع الأدوات المختلفة التي تحاكي آلية محددة من الفم الحشرات كافية للتسبب في إطلاق DAMPs وتحريك إنتاج الجينات الدفاعية. وغالبا ما تضاف المكونات الأخرى الخاصة بالحشرات مثل إفرازات الفم أو قلس لتكرار مساهمة HAMPs9،10،11. إنشاء حجم معين ونوع من الجرح وتطبيق كميات دقيقة من HAMPs هي ميزة واحدة لهذه الأنواع من الدراسات ويمكن أن تقدم المزيد من النتائج القابلة للاستنساخ. الدراسات العشبية الطبيعية، حيث يتم إنجاز الضرر الذي يلحق بالأنسجة النباتية من خلال تطبيق الحشرات المكتسبة في الميدان أو التي تربى مختبرًا، غالبًا ما تكون أكثر صعوبة لأن حجم الجرح وكميات HAMP يحكمها سلوك الحشرات وإضافة تباين إلى البيانات. الأساليب الطبيعية مقابل المحاكاة ومزاياها وعيوبها تناقش بشكل جيد في الأدب12،13،14.
لدراسة أحداث الإشارات المبكرة مثل عوامل النسخ، يجب استهلاك نسبة مئوية معينة من الورقة في فترة زمنية قصيرة نسبيا، لذلك يجب أن تبدأ اليرقات في المضغ على الفور والحفاظ على الاستهلاك حتى يتم تجميد الورقة لتحليلها. M. sexta هو مغذي شره على النباتات السولاناسيوس متعددة خلال العديد من مراحل اليرقات، مما يجعلها مثالية لنقل أقصى قدر من الضرر في فترة قصيرة نسبيا من الزمن15. هذا هو مريح عند دراسة الأحداث إشارة في وقت مبكر، كما يحدث استجابة النبات على الفور تقريبا بعد الحشرات يتصل سطح ورقة16،17. ويثبت أسلوب الاحتواء الشائع استخداماً في قفص المشبك أنه خرقاء، لأن الأقفاص المتعددة تتطلب تعديلات مستمرة طوال التجربة للسماح بإزالة اليرقات أو إضافتها. يجب أن تكون الأوراق أيضا كبيرة بما فيه الكفاية وقوية بما فيه الكفاية لدعم الحشرات متعددة التغذية في نفس الوقت. هذه الأنواع من نباتات البطاطا تتطلب مساحة كبيرة لمراقبة التغذية. وغالبا ما تنتقل اليرقات إلى الجانب السفلي من سطح الأوراق مما يجعل أيضا ملاحظات التغذية صعبة للغاية. ومن الواضح أن استخدام نباتات كاملة لإجراء هذه التجارب أمر مرهق.
الدراسة الحالية يستخدم أوراق منفصلة معزولة في أطباق بيتري بدلا من النباتات كلها لتبسيط وتبسيط نهج النبات كله لدراسة الأعشاب العاج. يقتصر تطبيق البروتوكول في هذه الدراسة على مراقبة مجموعة من عوامل النسخ C2H2 الناجمة في وقت مبكر في أوراق البطاطس بعد الضرر العشبي من قبل يرقات M. sexta.
Protocol
Representative Results
Discussion
استخدام المنهجيات النباتية الكاملة الأعشاب غير ضرورية لتحقيق هدف هذه الدراسة بالذات (أي فحص مجموعة من الجينات المرشحة لاستجابتها للإصابة). الفائدة الواضحة من صقل ورقة منفصلة هو تقصير الوقت الذي يستغرقه لأداء الاختبارات herbivory. يتم القضاء على الطبيعة غير العملية للنباتات كلها مع أقفاص كلي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا بوب فارار وأليكسيس بارك على تزويدهما بالحشرات المستخدمة في هذه الدراسة وعلى خبرتهما في تنظيم اليرقات. شكر إضافي لمايكل بلاكبيرن وسايكات غوش للمراجعة النقدية للمخطوطة.
إن ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية في هذا المنشور هو فقط لغرض تقديم معلومات محددة ولا يعني توصية أو تأييد من وزارة الزراعة الأميركية.
وزارة الزراعة الأمريكية هي مزود تكافؤ الفرص وصاحب العمل.
Materials
| agar substitute | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | product is Gelzan |
| containment vessel (6,12 or 24 well dish) | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | many other companies sell these products |
| manduca eggs | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30-50 eggs |
| manduca eggs | Great Lakes Hornworm | NA | 50, 100, 250 or 500 eggs |
| manduca larvae | Carolina Biological Supply Company | call for specific larval instar requests | any instar |
| manduca larvae | Great Lakes Hornworm | call for specific larval instar requests | any instar |
| microcentrifuge tubes, 1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | these have been tested in liquid N2 and will not explode |
| Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins | PhytoTechnology Laboratories | M519 | used to make propagation medium |
| nutrient agar mix | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan |
| paper filter discs | Fisher Scientific | 09-805A | Whatman circles-purchase to fit in petri dish |
| petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A or FB0875712 | purchase size appropriate for leaf size |
| potato tubers | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| pots, 10" | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| preservative/biocide | Plant Cell Technology | NA | product is PPM (Plant Preservative Mixture) |
| seed potatoes for explant source | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| slow release fertilizer (14-14-14 ) | any | NA | Osmocote is a popular brand name |
| soft touch forceps | BioQuip | 4750 | |
| soil mix | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | product is Sunshine LC1 mix |
| sterile culture vessel | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Magenta-type vessel, PTL-100 |
| sterile culture vessel | Fisher Scientific | ICN2672206 | product is MP Biomedicals Plantcon |
References
- Choi, H. W., Klessig, D. F. DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity. BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).
- Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins. Science. 253, 895-897 (1991).
- Savatin, D. V., Gramegna, G., Modesti, V., Cervone, F. Wounding in the plant tissue: the defense of a dangerous passage. Frontiers in Plant Science. 470 (5), 1-11 (2014).
- Basu, S., Varsanit, S., Louis, J. Altering Plant Defenses: Herbivore-Associated Molecular Patterns and Effector Arsenal of Chewing Herbivores. Molecular Plant-Microbe Interactions. 31, 13-21 (2018).
- Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110, 15728-15733 (2013).
- Chen, M. -. S. Inducible direct plant defense against insect herbivores: A review. Insect Science. 15, 101-114 (2008).
- Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in jasmonate signaling for multistress resilience. Annual Review of Plant Biology. 69, 387-415 (2018).
- War, A. R., et al. Plant defence against herbivory and insect adaptations. AoB PLANTS. 10 (4), 1-19 (2018).
- McCloud, E. S., Baldwin, I. T. Herbivory and caterpillar regurgitants amplify the wound-induced increases in jasmonic acid but not nicotine in Nicotiana sylvestris. Planta. 203, 430-435 (1997).
- Schittko, U., Hermsmeier, D., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate: II. Accumulation of plant mRNAs responding to insect-derived cues. Plant Physiology. , 701-710 (2001).
- Halitschke, R., Schittko, U., Pohnert, G., Boland, W., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate. III. Fatty acid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient for herbivore-specific plant responses. Plant Physiology. 125, 711-717 (2001).
- Lortzing, T., et al. Transcriptomic responses of Solanum dulcamara to natural and simulated herbivory. Molecular Ecology Resources. 17, 1-16 (2017).
- Hjältén, J. Simulating herbivory: problems and possibilities. Ecological Studies. 173, 243-255 (2004).
- Lehtilä, K., Boalt, E. The use and usefulness of artificial herbivory in plant-herbivore studies. Ecological Studies. 173, 257-275 (2004).
- Schittko, U., Preston, C. A., Baldwin, I. T. Eating the evidence? Manduca sexta larvae can not disrupt specific jasmonate induction in Nicotiana attenuata by rapid consumption. Planta. 210, 343-346 (2000).
- Zebelo, S. A., Maffei, M. E. Role of early signalling events in plant-insect interactions. Journal of Experimental Botany. 66, 435-448 (2015).
- Maffei, M. E., Mithofer, A., Boland, W. Before gene expression: early events in plant-insect interaction. Trends in Plant Science. 12, 310-316 (2007).
- Goodwin, P. B., Adisarwanto, T. Propagation of potato by shoot tip culture in Petri dishes. Potato Research. 23, 445-448 (1980).
- Goodwin, P. B. Rapid propagation of potato by single node cuttings. Field Crops Research. 4, 165-173 (1981).
- Martin, P. A. W., Blackburn, M. B. Using combinatorics to screen Bacillus thuringiensis isolates for toxicity against Manduca sexta and Plutella xylostella. Biological Control. 42, 226-232 (2007).
- Bell, R. A., Joachim, F. G. Techniques for rearing laboratory colonies of tobacco hornworms and pink bollworms. Annals of the Entomological Society of America. 69 (2), 365-373 (1976).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G. The remarkable plethora of infestation-responsive Q-type C2H2 transcription factors in potato. BMC Research Notes. 11, 1-7 (2018).
- Green, J. M., et al. PhenoPhyte: a flexible affordable method to quantify 2D phenotypes from imagery. Plant Methods. 8 (45), 1-12 (2012).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G., Jones, R. W., Farrar, R. R., Blackburn, M. B. Herbivory responsive C2H2 zinc finger transcription factor protein StZFP2 from potato. Plant Physiology and Biochemistry. 80, 226-233 (2014).
- Korth, K. L., Dixon, R. A. Evidence for chewing insect-specific molecular events distinct from a general wound response in leaves. Plant Physiology. 115, 1299-1305 (1997).
- Browne, R. A., Cooke, B. M. Development and evaluation of an in vitro detached leaf assay for pre-screening resistance to Fusarium head blight in wheat. European Journal of Plant Pathology. 110, 91-102 (2004).
- Browne, R. A., et al. Evaluation of components of fusarium head blight resistance in soft red winter wheat germ plasm using a detached leaf assay. Plant Disease. 89, 404-411 (2005).
- Michel, A. P., Rouf Mian, M. A., Davila-Olivas, N. H., Canas, L. A. Detached leaf and whole plant assays for soybean aphid resistance: differential responses among resistance sources and biotypes. Journal of Economic Entomology. 103, 949-957 (2010).
- Sharma, H. C., Pampapathy, G., Dhillon, M. K., Ridsdill-Smith, J. T. Detached leaf assay to screen for host plant resistance to Helicoverpa armigera. Journal of Economic Entomology. 98, 568-576 (2005).
- Vivianne, G. A. A., et al. A laboratory assay for Phytophthora infestans resistance in various Solanum species reflects the field situation. European Journal of Plant Pathology. 105, 241-250 (1999).
- Kamoun, S., et al. A gene encoding a protein elicitor of Phytophthora infestans is down-regulated during infection of potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 10, 13-20 (1997).
- Nowakowska, M., Nowicki, M., Kłosińska, U., Maciorowski, R., Kozik, E. U. Appraisal of artificial screening techniques of tomato to accurately reflect field performance of the Late Blight resistance. Plos One. 9, e109328 (2014).
- Arimura, G., et al. Herbivory-induced volatiles elicit defence genes in lima bean leaves. Nature. 406, 512-515 (2000).
- Erb, M. Volatiles as inducers and suppressors of plant defense and immunity-origins, specificity, perception and signaling. Current Opinion in Plant Biology. 44, 117-121 (2018).
- Hasegawa, S., et al. Gene expression analysis of wounding-induced root-to-shoot communication in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell and Environment. 34, 705-716 (2011).
- Ryan, C. A., Moura, D. S. Systemic wound signaling in plants: A new perception. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 6519-6520 (2002).
- Hilleary, R., Gilroy, S. Systemic signaling in response to wounding and pathogens. Current Opinion in Plant Biology. 43, 57-62 (2018).
- . Hornworms Available from: https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr (2018)
- . Products Available from: https://www.greatlakeshornworm.com/products/ (2018)
- . Raising Manduca sexta Available from: https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html (2018)
- . Teach life cycles with the tobacco hornworm Available from: https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr (2018)
- Chung, S. H., et al. Host plant species determines symbiotic bacterial community mediating suppression of plant defenses. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
