Müstakil yaprak özendirme, Çiğneme böcek Manduca Sexta tarafından Infestation sırasında patates gen Ifade çalışmaları basitleştirmek için
Summary
Sunulan yöntem, Manduca Sexta larvası uygulama aracılığıyla doğal otobur hasarlı bitki dokusu oluşturur patates ayrılmış yaprakları. Bitki dokusu böcek herbivory erken tepkiler dahil altı transkripsiyon faktör homolog ifadesi için farklı teknik kullanılarak.
Abstract
Böcek otoburluğu gen ifade çalışmalarının multitrofik doğası biyolojik çoğaltır, daha basit, daha aerodinamik otoburluğu protokolleri için ihtiyaç yaratan çok sayıda gerektirir. Çiğneme böceklerin perturbations genellikle tüm bitki sistemlerinde incelenmiştir. Bu tüm organizma stratejisi popüler iken, benzer gözlemler tek bir müstakil yaprak çoğaltılabilir Eğer gerekli değildir. Varsayım, sinyal dönüştürücü için gerekli temel öğelerin yaprak kendisi içinde mevcut olmasıdır. Sinyal dönüştürücünde erken olaylar durumunda, hücrelerin sadece pertürasyon sinyali almak ve bu sinyal gen ifadesi için farklı teknik kullanılarak komşu hücrelere iletmek gerekir.
Önerilen yöntem sadece dekolmanı zamanlamasını değiştirir. Tüm bitki deneylerinde, larvalar sonunda bitkinden ayrılmış ve gen ifadesi için yapılan tek bir yaprak ile sınırlıdır. Eğer eksizyon sırası tersine, tüm bitki çalışmalarında son, Müstakil çalışmada ilk, besleme deneyi basitleştirilmiştir.
Solanum tüberozum var. Kennebec basit bir doku kültürü ortamında nodal transferi ile yayılır ve istenirse daha fazla büyüme için toprağa aktarılır. Yaprakları ebeveyn bitkinden eksiz ve beslenme tahlil M. Sextalarva aşamaları ile yürütülen Petri yemekleri taşındı. Hasar görmüş yaprak dokusu, sinyal dönüştürücünde nispeten erken olayların ifadesinde görülmektedir. Gen ifadesi analizi, erken tepki çalışmalarında müstakil yaprakları kullanmanın başarısını teyit eden, istila-spesifik Cys2-His2 (C2H2) transkripsiyon faktörlerini belirledi. Yöntem tüm bitki istilaları daha gerçekleştirmek için daha kolay ve daha az yer kullanır.
Introduction
Herbivory, bir bitkinin hem saldırıyı tanımlayacağı hem de hayatta kalabilmesi için uygun bir tepkiye sahip olduğu bir dizi moleküler olayı hareket halinde ayarlar. Bir bitki çiğneme böceklerden iki temel ipuçları alır; doku ve diğer böcek spesifik maddelerden fiziksel hasar biri. Hasar ile ilişkili moleküler desenler (damps) larva ağızlı tarafından oluşturulan hasarlara yanıt olarak serbest bırakılır ve iyi tanımlanmış bir yara yanıtı tetiklemek, hormon jasmonik asit ve savunma genler transkripsiyon bir artış sonuçları1. En iyi bilinen damps biri systemin, bir yaprak yaralandıktan sonra büyük prosystemin protein bölünme tarafından oluşturulan bir polipeptid olduğunu2,3. Jasmonik asit yara tepkisi, Caterpillar tükürük, gut içeriği (regurgitant) ve dışkı (Frass)4elde edilebilir herbivore ilişkili moleküler desenler (hamps), daha da modüle edilir. Böcekler, savunma tepkisi5‘ i artırmak veya kaçınmak için bu maddeleri kullanır. Transkripsiyon faktörleri daha sonra akış savunma genler düzenlenmesi ile savunma tepkisi hormon sinyalleri gelen mesaj röle6,7,8.
Laboratuar ayarlarında kullanılan bazı bitki böcek etkileşimi çalışmaları, böcek tarafından beslenme doğal yöntemi yaklaşarak bir amacı ile simüle türü vardır. Simüle otoburluğu genellikle damps serbest bırakılması neden ve savunma genler üretimini tetiklemek için yeterli böcek ağlarının belirli mekanizmasını taklit çeşitli araçlar ile bitki dokularına yapay hasar oluşturarak gerçekleştirilir. Oral salgıları veya Regürjitasyonlu gibi diğer böcek özgü bileşenleri genellikle9,10,11hamps katkı çoğaltmak için eklenir. Belirli bir boyut ve yara türü oluşturulması ve HAMPs kesin miktarlarda uygulama bu tür çalışmalar için bir avantajdır ve daha tekrarlanabilir sonuçlar sunabilir. Bitki dokusuna zarar alan elde edilen veya laboratuar-reared böcekler uygulaması ile gerçekleştirildiği doğal otoburluğu çalışmalar, genellikle daha zor çünkü yara boyutu ve Hamp tutarlar böcek davranışına göre yönetilir ve değişkenlik eklemek Veri. Doğal VERSUS simülasyonu yöntemleri ve avantajları ve dezavantajları literatürde tartışılır12,13,14.
Transkripsiyon faktörleri gibi erken sinyalizasyon olaylarını incelemek için, yaprak belirli bir yüzdesi nispeten kısa bir süre içinde tüketilen olmalıdır, bu yüzden larva hemen çiğnemek ve yaprak analiz için dondurulmuş kadar tüketimini sürdürmek gerekir. M. Sexta , larva aşamalarının birçoğu sırasında birden fazla solanaceous bitkide bulunan, nispeten kısa bir süre içinde maksimum hasar vermek için ideal olan15. Bu, erken sinyal olaylarını okurken, bitki tepkisi hemen hemen bir böcek yaprak yüzeyi16,17iletişim sonra oluştuğu için uygundur. Birden fazla kafes larvaların kaldırılması veya eklenmesi için izin vermek için deney boyunca sürekli ayarlamalar gerektirecektir gibi koruma yaygın kullanılan klip kafes yöntemi, sakar kanıtlıyor. Yaprakları da yeterince büyük ve aynı zamanda birden fazla böcek besleme desteklemek için yeterince güçlü olmalıdır. Bu tür patates bitkileri beslenme gözlemlemek için alan büyük miktarda gerektirir. Larva genellikle aynı zamanda besleme gözlemlerini oldukça zor kılan yaprak yüzeyinin alt tarafına taşınacaktır. Bu deneyler yapmak için tüm bitkiler kullanarak açıkça hantal olduğunu.
Mevcut çalışmada, herbivory eğitimi için tüm bitki yaklaşımı kolaylaştırmak ve kolaylaştırmak için tüm bitkiler yerine Petri yemeklerinde izole müstakil yaprakları kullanır. Bu çalışmada protokolün uygulanması, M. Sexta larvaları tarafından herbivoröz hasarlardan sonra patates yaprakları erken Indüklenen C2H2 transkripsiyon faktörlerinin bir grup gözlem sınırlıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut tüm bitki otoburluğu metodolojilerinin kullanımı bu özel çalışmanın hedefini elde etmek için gereksiz (yani, istilası için onların tepkisi için aday genler bir dizi ekran). Müstakil yaprak arıtma bariz yararı otoburluğu assays gerçekleştirmek için gereken süreyi kısaltmak olduğunu. Klip kafesleri ile tüm bitkilerin hantal doğası ortadan kaldırılmıştır ve iki hafta gibi genç bitkiler hasat yaprakları için kullanılabilir olduğundan, daha erken gerçekleştirilir. Ayrıca, beslenm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, bu çalışmada kullanılan böcekler ve larva evrelendirme konusunda uzmanlık için Bob Farrar ve Alexis Park ‘a teşekkür etmek ister. El yazması kritik İnceleme için Michael Blackburn ve Saikat güneş ek teşekkürler.
Bu yayındaki ticari isimlerden veya ticaret ürünlerinden Bahsedilmek sadece belirli bilgileri sağlamak amacıyla yapılır ve ABD Tarım Bakanlığı tarafından tavsiye veya onay anlamına gelmez.
USDA bir eşit fırsat sağlayıcı ve Işveren olduğunu.
Materials
| agar substitute | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | product is Gelzan |
| containment vessel (6,12 or 24 well dish) | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | many other companies sell these products |
| manduca eggs | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30-50 eggs |
| manduca eggs | Great Lakes Hornworm | NA | 50, 100, 250 or 500 eggs |
| manduca larvae | Carolina Biological Supply Company | call for specific larval instar requests | any instar |
| manduca larvae | Great Lakes Hornworm | call for specific larval instar requests | any instar |
| microcentrifuge tubes, 1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | these have been tested in liquid N2 and will not explode |
| Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins | PhytoTechnology Laboratories | M519 | used to make propagation medium |
| nutrient agar mix | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan |
| paper filter discs | Fisher Scientific | 09-805A | Whatman circles-purchase to fit in petri dish |
| petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A or FB0875712 | purchase size appropriate for leaf size |
| potato tubers | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| pots, 10" | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| preservative/biocide | Plant Cell Technology | NA | product is PPM (Plant Preservative Mixture) |
| seed potatoes for explant source | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| slow release fertilizer (14-14-14 ) | any | NA | Osmocote is a popular brand name |
| soft touch forceps | BioQuip | 4750 | |
| soil mix | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | product is Sunshine LC1 mix |
| sterile culture vessel | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Magenta-type vessel, PTL-100 |
| sterile culture vessel | Fisher Scientific | ICN2672206 | product is MP Biomedicals Plantcon |
References
- Choi, H. W., Klessig, D. F. DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity. BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).
- Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins. Science. 253, 895-897 (1991).
- Savatin, D. V., Gramegna, G., Modesti, V., Cervone, F. Wounding in the plant tissue: the defense of a dangerous passage. Frontiers in Plant Science. 470 (5), 1-11 (2014).
- Basu, S., Varsanit, S., Louis, J. Altering Plant Defenses: Herbivore-Associated Molecular Patterns and Effector Arsenal of Chewing Herbivores. Molecular Plant-Microbe Interactions. 31, 13-21 (2018).
- Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110, 15728-15733 (2013).
- Chen, M. -. S. Inducible direct plant defense against insect herbivores: A review. Insect Science. 15, 101-114 (2008).
- Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in jasmonate signaling for multistress resilience. Annual Review of Plant Biology. 69, 387-415 (2018).
- War, A. R., et al. Plant defence against herbivory and insect adaptations. AoB PLANTS. 10 (4), 1-19 (2018).
- McCloud, E. S., Baldwin, I. T. Herbivory and caterpillar regurgitants amplify the wound-induced increases in jasmonic acid but not nicotine in Nicotiana sylvestris. Planta. 203, 430-435 (1997).
- Schittko, U., Hermsmeier, D., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate: II. Accumulation of plant mRNAs responding to insect-derived cues. Plant Physiology. , 701-710 (2001).
- Halitschke, R., Schittko, U., Pohnert, G., Boland, W., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate. III. Fatty acid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient for herbivore-specific plant responses. Plant Physiology. 125, 711-717 (2001).
- Lortzing, T., et al. Transcriptomic responses of Solanum dulcamara to natural and simulated herbivory. Molecular Ecology Resources. 17, 1-16 (2017).
- Hjältén, J. Simulating herbivory: problems and possibilities. Ecological Studies. 173, 243-255 (2004).
- Lehtilä, K., Boalt, E. The use and usefulness of artificial herbivory in plant-herbivore studies. Ecological Studies. 173, 257-275 (2004).
- Schittko, U., Preston, C. A., Baldwin, I. T. Eating the evidence? Manduca sexta larvae can not disrupt specific jasmonate induction in Nicotiana attenuata by rapid consumption. Planta. 210, 343-346 (2000).
- Zebelo, S. A., Maffei, M. E. Role of early signalling events in plant-insect interactions. Journal of Experimental Botany. 66, 435-448 (2015).
- Maffei, M. E., Mithofer, A., Boland, W. Before gene expression: early events in plant-insect interaction. Trends in Plant Science. 12, 310-316 (2007).
- Goodwin, P. B., Adisarwanto, T. Propagation of potato by shoot tip culture in Petri dishes. Potato Research. 23, 445-448 (1980).
- Goodwin, P. B. Rapid propagation of potato by single node cuttings. Field Crops Research. 4, 165-173 (1981).
- Martin, P. A. W., Blackburn, M. B. Using combinatorics to screen Bacillus thuringiensis isolates for toxicity against Manduca sexta and Plutella xylostella. Biological Control. 42, 226-232 (2007).
- Bell, R. A., Joachim, F. G. Techniques for rearing laboratory colonies of tobacco hornworms and pink bollworms. Annals of the Entomological Society of America. 69 (2), 365-373 (1976).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G. The remarkable plethora of infestation-responsive Q-type C2H2 transcription factors in potato. BMC Research Notes. 11, 1-7 (2018).
- Green, J. M., et al. PhenoPhyte: a flexible affordable method to quantify 2D phenotypes from imagery. Plant Methods. 8 (45), 1-12 (2012).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G., Jones, R. W., Farrar, R. R., Blackburn, M. B. Herbivory responsive C2H2 zinc finger transcription factor protein StZFP2 from potato. Plant Physiology and Biochemistry. 80, 226-233 (2014).
- Korth, K. L., Dixon, R. A. Evidence for chewing insect-specific molecular events distinct from a general wound response in leaves. Plant Physiology. 115, 1299-1305 (1997).
- Browne, R. A., Cooke, B. M. Development and evaluation of an in vitro detached leaf assay for pre-screening resistance to Fusarium head blight in wheat. European Journal of Plant Pathology. 110, 91-102 (2004).
- Browne, R. A., et al. Evaluation of components of fusarium head blight resistance in soft red winter wheat germ plasm using a detached leaf assay. Plant Disease. 89, 404-411 (2005).
- Michel, A. P., Rouf Mian, M. A., Davila-Olivas, N. H., Canas, L. A. Detached leaf and whole plant assays for soybean aphid resistance: differential responses among resistance sources and biotypes. Journal of Economic Entomology. 103, 949-957 (2010).
- Sharma, H. C., Pampapathy, G., Dhillon, M. K., Ridsdill-Smith, J. T. Detached leaf assay to screen for host plant resistance to Helicoverpa armigera. Journal of Economic Entomology. 98, 568-576 (2005).
- Vivianne, G. A. A., et al. A laboratory assay for Phytophthora infestans resistance in various Solanum species reflects the field situation. European Journal of Plant Pathology. 105, 241-250 (1999).
- Kamoun, S., et al. A gene encoding a protein elicitor of Phytophthora infestans is down-regulated during infection of potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 10, 13-20 (1997).
- Nowakowska, M., Nowicki, M., Kłosińska, U., Maciorowski, R., Kozik, E. U. Appraisal of artificial screening techniques of tomato to accurately reflect field performance of the Late Blight resistance. Plos One. 9, e109328 (2014).
- Arimura, G., et al. Herbivory-induced volatiles elicit defence genes in lima bean leaves. Nature. 406, 512-515 (2000).
- Erb, M. Volatiles as inducers and suppressors of plant defense and immunity-origins, specificity, perception and signaling. Current Opinion in Plant Biology. 44, 117-121 (2018).
- Hasegawa, S., et al. Gene expression analysis of wounding-induced root-to-shoot communication in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell and Environment. 34, 705-716 (2011).
- Ryan, C. A., Moura, D. S. Systemic wound signaling in plants: A new perception. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 6519-6520 (2002).
- Hilleary, R., Gilroy, S. Systemic signaling in response to wounding and pathogens. Current Opinion in Plant Biology. 43, 57-62 (2018).
- . Hornworms Available from: https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr (2018)
- . Products Available from: https://www.greatlakeshornworm.com/products/ (2018)
- . Raising Manduca sexta Available from: https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html (2018)
- . Teach life cycles with the tobacco hornworm Available from: https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr (2018)
- Chung, S. H., et al. Host plant species determines symbiotic bacterial community mediating suppression of plant defenses. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
