מנותקת עלה assays לפשט גנים ביטוי לימודי תפוחי אדמה במהלך התפשטות על ידי לעיסת חרק manduca סקסטה
Summary
השיטה המוצגת יוצרת הרביוור טבעי הנזק רקמת הצמח באמצעות היישום של מנדוקה הזחלים סקסטה להתנתק עלים של תפוחי אדמה. רקמת הצמח הוא הבעה ביטוי של שישה שעתוק גורם הומויומני מעורב בתגובות מוקדמות לחרקים העשב.
Abstract
הטבע הmultitrophic של לימודי גנים של העשב המאלף חרקים דורש מספר רב של משכפל ביולוגי, היוצר את הצורך לפרוטוקולים פשוטים ויעילים יותר של העשב. רטבאליות של חרקים לעיסה לומדים בדרך כלל במערכות צמחים שלמות. בעוד שאסטרטגיית האורגניזם הזאת פופולרית, אין בכך צורך אם ניתן לשכפל תצפיות דומות בעלה מנותק אחד. ההנחה היא שאלמנטים בסיסיים הנדרשים להתמרה של אותות נמצאים בתוך העלה עצמו. במקרה של אירועים מוקדמים של התמרה אותות, התאים צריכים רק כדי לקבל את האות מתוך הפרטורציה ולשדר את האות לתאים השכנים אשר מחכים לביטוי גנים.
השיטה המוצעת פשוט משנה את התזמון של הניתוק. בניסויים צמחיים שלמים, הזחלים מוגבלים לעלה בודד אשר מנותקת בסופו של דבר מן הצמח ומרותק לביטוי גנים. אם הסדר של כריתה מתהפך, מאחרון בלימודי המפעל כולו, לראשונה במחקר הפרטי, ניסוי ההזנה הוא פשוט.
. סולנום טובראוסום באר קנאו מופץ על ידי העברה קטרי במדיום תרבות פשוטה בינונית והועברה קרקע לצמיחה נוספת אם תרצה. העלים מוגשים ממפעל ההורים והועברו למנות פטרי שבהן מתנהל שיטת ההזנה עם שלבי הזחל של מדיום. רקמת עלה פגומה הינה לביטוי של אירועים מוקדמים יחסית של התמרה אותות. ניתוח ביטויים גנטיים זיהה התפשטות Cys2-His2 (C2H2) גורמים שעתוק, המאשרת את ההצלחה של שימוש בעלים מנותקים במחקרים מוקדמים של התגובה. השיטה היא קלה יותר לבצע מאשר הצמח שלמות התחנות והוא משתמש פחות שטח.
Introduction
הרבורי מגדיר בתנועה סדרה של אירועים מולקולריים שבהם צמח יכול לזהות את המתקפה ולטעון תגובה מתאימה להישרדותה. צמח מקבל שני רמזים בסיסיים מלעיסת חרקים; אחד מהנזק הפיזי לרקמה ולשני מחומרים ספציפיים לחרקים. תבניות מולקולריות משויכות לנזקים (DAMPs) שוחררו בתגובה לנזק שנוצר על-ידי חלקי הזחל ומפעיל תגובת פציעה מוגדרת היטב הנובעת מגידול בחומצה ההורמון לימונית ותמלול גנים הביטחון1. אחד מהדואמפר הידועים ביותר הוא מערכת, פוליפפטיד הנוצרת על ידי המחשוף של החלבון prosystemin גדול יותר לאחר עלה נפצע2,3. התגובה הפצע החומצה הממונית הוא עוד מאופנן על ידי דפוסי מולקולרי הרביוור-הקשורים (HAMPs), אשר יכול להיות נגזר רוק זחל, תוכן המעיים (regurgitant) וצואה (frass)4. חרקים להשתמש בחומרים אלה כדי להגביר או להתחמק תגובת ההגנה5. גורמים שעתוק ולאחר מכן ממסר את ההודעה מפני אותות הורמונים בתגובה הביטחון באמצעות רגולציה של גנים הביטחון במורד הזרם6,7,8.
חלק ממחקרי האינטראקציה עם חרקים מהמפעל המשמשים במסגרות מעבדה הם מסוג הסימולציה, עם מטרה לקירוב השיטה הטבעית של האכלה על ידי החרק. העשב מדומה מושגת בדרך כלל על ידי יצירת נזק מלאכותי לרקמות הצמח עם כלים שונים המחקים את המנגנון הספציפי של חלקי החרקים מספיק כדי לגרום לשחרור של DAMPs ולהפעיל את הייצור של גנים הביטחון. רכיבים אחרים ספציפיים לחרקים כגון הפרשות אוראלי או regurgitant מתווספים לעתים קרובות כדי לשכפל את התרומה של hamps9,10,11. הקמתה של גודל מסוים וסוג של פצע ואת היישום של כמויות מדויקות של HAMPs הוא אחד היתרונות לסוגים אלה של מחקרים והוא יכול להציע תוצאות שניתן להפיק יותר. טבעי לימודי העשב, היכן נזק לרקמת הצמח מושגת על ידי יישום של חרקים נרכש או מעבדה-הגדלים המעבדה, הם לעתים קרובות יותר מאתגרת בגלל הפצע בגודל וכמויות hamp נשלטים על ידי התנהגות החרק ולהוסיף שינויים ב נתונים. השיטות הטבעיות לעומת מדומה והיתרונות והחסרונות שלהם הינם לדיון היטב בספרות12,13,14.
כדי ללמוד אירועים איתות מוקדם כגון גורמי שעתוק, אחוז מסוים של העלה חייב להיות נצרך בפרק זמן קצר יחסית, כך הזחלים חייבים להתחיל ללעוס מיד לשמור על צריכת עד העלה קפוא לניתוח. M. סקסטה הוא ממזין משוכן על מספר צמחים solanאכאאוס במהלך רבים של שלבי הזחל שלה, מה שהופך אותו אידיאלי לקבלת נזק מקסימלי בפרק זמן קצר יחסית של15. זה נוח כאשר לומדים האירועים איתות מוקדם, כמו תגובת הצמח מתרחשת כמעט מיד לאחר שחרק מקשר את פני העלה16,17. שיטת הבלימה הנפוצה ביותר בשימוש בכלוב מוכיחה מגושמת, משום שכלובים מרובים ידרשו התאמות מתמיד במהלך הניסוי כדי לאפשר הסרה או הוספה של הזחלים. העלים חייבים גם להיות גדולים מספיק וחזקים מספיק כדי לתמוך בחרקים מרובים האכלה באותו זמן. סוגים אלה של צמחי תפוחי אדמה דורשים כמות גדולה של שטח להתבונן האכלה. הזחלים מפרידים לעתים קרובות אל החלק התחתון של משטח העלה אשר גם עושה תצפיות האכלה די קשה. באמצעות צמחים שלמים לבצע ניסויים אלה הוא מסורבל בבירור.
המחקר הנוכחי משתמש בעלים מבודדים בצלחות פטרי במקום צמחים שלמים כדי לייעל ולפשט את הגישה המפעל כולו כדי ללמוד העשב vory. היישום של הפרוטוקול במחקר זה מוגבל להתבוננות של קבוצה של הגורמים C2H2 המושרה מוקדם בעלי תפוחי אדמה לאחר נזק העשב על ידי הזחלים מ. סקסטה .
Protocol
Representative Results
Discussion
השימוש הקיים הצמח כולו מתודולוגיות העשב הוא מיותר להשיג את המטרה של מחקר מסוים זה (כלומר, המסך מערכת של גנים המועמדים לתגובה שלהם התפשטות). היתרון הברור של עידון העלה הפרטי הוא קיצור הזמן שלוקח לבצע העשב vory assays. הטבע המרפא של צמחים שלמים עם כלובים מסולקים מסולק והוא מבוצע מוקדם יותר, מאז הצמ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות בוב Farrar ואלקסיס פארק עבור מתן חרקים המשמשים במחקר זה ועבור המומחיות שלהם בזחל הזמני. תודות למייקל בלקברן ולסקאט גוש לסקירה קריטית של כתב היד.
ציון שמות המסחר או מוצרים מסחריים בפרסום זה מיועד אך ורק לצורך מתן מידע ספציפי ואינו מעיד על המלצה או אישור על ידי משרד החקלאות של ארצות הברית.
משרד החקלאות הוא ספק הזדמנויות שוות ומעסיק.
Materials
| agar substitute | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | product is Gelzan |
| containment vessel (6,12 or 24 well dish) | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | many other companies sell these products |
| manduca eggs | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30-50 eggs |
| manduca eggs | Great Lakes Hornworm | NA | 50, 100, 250 or 500 eggs |
| manduca larvae | Carolina Biological Supply Company | call for specific larval instar requests | any instar |
| manduca larvae | Great Lakes Hornworm | call for specific larval instar requests | any instar |
| microcentrifuge tubes, 1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | these have been tested in liquid N2 and will not explode |
| Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins | PhytoTechnology Laboratories | M519 | used to make propagation medium |
| nutrient agar mix | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan |
| paper filter discs | Fisher Scientific | 09-805A | Whatman circles-purchase to fit in petri dish |
| petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A or FB0875712 | purchase size appropriate for leaf size |
| potato tubers | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| pots, 10" | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| preservative/biocide | Plant Cell Technology | NA | product is PPM (Plant Preservative Mixture) |
| seed potatoes for explant source | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| slow release fertilizer (14-14-14 ) | any | NA | Osmocote is a popular brand name |
| soft touch forceps | BioQuip | 4750 | |
| soil mix | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | product is Sunshine LC1 mix |
| sterile culture vessel | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Magenta-type vessel, PTL-100 |
| sterile culture vessel | Fisher Scientific | ICN2672206 | product is MP Biomedicals Plantcon |
References
- Choi, H. W., Klessig, D. F. DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity. BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).
- Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins. Science. 253, 895-897 (1991).
- Savatin, D. V., Gramegna, G., Modesti, V., Cervone, F. Wounding in the plant tissue: the defense of a dangerous passage. Frontiers in Plant Science. 470 (5), 1-11 (2014).
- Basu, S., Varsanit, S., Louis, J. Altering Plant Defenses: Herbivore-Associated Molecular Patterns and Effector Arsenal of Chewing Herbivores. Molecular Plant-Microbe Interactions. 31, 13-21 (2018).
- Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110, 15728-15733 (2013).
- Chen, M. -. S. Inducible direct plant defense against insect herbivores: A review. Insect Science. 15, 101-114 (2008).
- Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in jasmonate signaling for multistress resilience. Annual Review of Plant Biology. 69, 387-415 (2018).
- War, A. R., et al. Plant defence against herbivory and insect adaptations. AoB PLANTS. 10 (4), 1-19 (2018).
- McCloud, E. S., Baldwin, I. T. Herbivory and caterpillar regurgitants amplify the wound-induced increases in jasmonic acid but not nicotine in Nicotiana sylvestris. Planta. 203, 430-435 (1997).
- Schittko, U., Hermsmeier, D., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate: II. Accumulation of plant mRNAs responding to insect-derived cues. Plant Physiology. , 701-710 (2001).
- Halitschke, R., Schittko, U., Pohnert, G., Boland, W., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate. III. Fatty acid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient for herbivore-specific plant responses. Plant Physiology. 125, 711-717 (2001).
- Lortzing, T., et al. Transcriptomic responses of Solanum dulcamara to natural and simulated herbivory. Molecular Ecology Resources. 17, 1-16 (2017).
- Hjältén, J. Simulating herbivory: problems and possibilities. Ecological Studies. 173, 243-255 (2004).
- Lehtilä, K., Boalt, E. The use and usefulness of artificial herbivory in plant-herbivore studies. Ecological Studies. 173, 257-275 (2004).
- Schittko, U., Preston, C. A., Baldwin, I. T. Eating the evidence? Manduca sexta larvae can not disrupt specific jasmonate induction in Nicotiana attenuata by rapid consumption. Planta. 210, 343-346 (2000).
- Zebelo, S. A., Maffei, M. E. Role of early signalling events in plant-insect interactions. Journal of Experimental Botany. 66, 435-448 (2015).
- Maffei, M. E., Mithofer, A., Boland, W. Before gene expression: early events in plant-insect interaction. Trends in Plant Science. 12, 310-316 (2007).
- Goodwin, P. B., Adisarwanto, T. Propagation of potato by shoot tip culture in Petri dishes. Potato Research. 23, 445-448 (1980).
- Goodwin, P. B. Rapid propagation of potato by single node cuttings. Field Crops Research. 4, 165-173 (1981).
- Martin, P. A. W., Blackburn, M. B. Using combinatorics to screen Bacillus thuringiensis isolates for toxicity against Manduca sexta and Plutella xylostella. Biological Control. 42, 226-232 (2007).
- Bell, R. A., Joachim, F. G. Techniques for rearing laboratory colonies of tobacco hornworms and pink bollworms. Annals of the Entomological Society of America. 69 (2), 365-373 (1976).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G. The remarkable plethora of infestation-responsive Q-type C2H2 transcription factors in potato. BMC Research Notes. 11, 1-7 (2018).
- Green, J. M., et al. PhenoPhyte: a flexible affordable method to quantify 2D phenotypes from imagery. Plant Methods. 8 (45), 1-12 (2012).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G., Jones, R. W., Farrar, R. R., Blackburn, M. B. Herbivory responsive C2H2 zinc finger transcription factor protein StZFP2 from potato. Plant Physiology and Biochemistry. 80, 226-233 (2014).
- Korth, K. L., Dixon, R. A. Evidence for chewing insect-specific molecular events distinct from a general wound response in leaves. Plant Physiology. 115, 1299-1305 (1997).
- Browne, R. A., Cooke, B. M. Development and evaluation of an in vitro detached leaf assay for pre-screening resistance to Fusarium head blight in wheat. European Journal of Plant Pathology. 110, 91-102 (2004).
- Browne, R. A., et al. Evaluation of components of fusarium head blight resistance in soft red winter wheat germ plasm using a detached leaf assay. Plant Disease. 89, 404-411 (2005).
- Michel, A. P., Rouf Mian, M. A., Davila-Olivas, N. H., Canas, L. A. Detached leaf and whole plant assays for soybean aphid resistance: differential responses among resistance sources and biotypes. Journal of Economic Entomology. 103, 949-957 (2010).
- Sharma, H. C., Pampapathy, G., Dhillon, M. K., Ridsdill-Smith, J. T. Detached leaf assay to screen for host plant resistance to Helicoverpa armigera. Journal of Economic Entomology. 98, 568-576 (2005).
- Vivianne, G. A. A., et al. A laboratory assay for Phytophthora infestans resistance in various Solanum species reflects the field situation. European Journal of Plant Pathology. 105, 241-250 (1999).
- Kamoun, S., et al. A gene encoding a protein elicitor of Phytophthora infestans is down-regulated during infection of potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 10, 13-20 (1997).
- Nowakowska, M., Nowicki, M., Kłosińska, U., Maciorowski, R., Kozik, E. U. Appraisal of artificial screening techniques of tomato to accurately reflect field performance of the Late Blight resistance. Plos One. 9, e109328 (2014).
- Arimura, G., et al. Herbivory-induced volatiles elicit defence genes in lima bean leaves. Nature. 406, 512-515 (2000).
- Erb, M. Volatiles as inducers and suppressors of plant defense and immunity-origins, specificity, perception and signaling. Current Opinion in Plant Biology. 44, 117-121 (2018).
- Hasegawa, S., et al. Gene expression analysis of wounding-induced root-to-shoot communication in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell and Environment. 34, 705-716 (2011).
- Ryan, C. A., Moura, D. S. Systemic wound signaling in plants: A new perception. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 6519-6520 (2002).
- Hilleary, R., Gilroy, S. Systemic signaling in response to wounding and pathogens. Current Opinion in Plant Biology. 43, 57-62 (2018).
- . Hornworms Available from: https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr (2018)
- . Products Available from: https://www.greatlakeshornworm.com/products/ (2018)
- . Raising Manduca sexta Available from: https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html (2018)
- . Teach life cycles with the tobacco hornworm Available from: https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr (2018)
- Chung, S. H., et al. Host plant species determines symbiotic bacterial community mediating suppression of plant defenses. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
