Vrijstaande blad testen voor het vereenvoudigen van genexpressie studies in aardappel tijdens besmetting door kauwen insect Manduca sexta
Summary
De gepresenteerde methode creëert natuurlijke herbivoor beschadigd plantenweefsel door de toepassing van Manduca sexta larven op losgeraakte bladeren van aardappel. Het plantenweefsel wordt onderzocht voor de uitdrukking van zes transcriptiefactor homologs die betrokken zijn bij vroege reacties op insecten herbivory.
Abstract
De Multitrofische aard van genexpressie studies van insecten ivoren eist grote aantallen biologische replicaten, waardoor de behoefte aan eenvoudigere, meer gestroomlijnde ivoren protocollen ontstaat. Perturbaties van vretende insecten worden meestal bestudeerd in hele planten systemen. Hoewel deze hele organisme strategie populair is, is het niet nodig als vergelijkbare waarnemingen in één vrijstaand blad kunnen worden gerepliceerd. De veronderstelling is dat de basiselementen die nodig zijn voor signaaltransductie aanwezig zijn in het blad zelf. In het geval van vroege gebeurtenissen in signaaltransductie hoeven cellen alleen het signaal van de perturbatie te ontvangen en dat signaal door te geven aan naburige cellen die worden aangevallen voor genexpressie.
De voorgestelde methode verandert eenvoudigweg de timing van het detachement. In hele planten experimenten zijn larven beperkt tot een enkel blad dat uiteindelijk loskomt van de plant en wordt aangevallen voor genexpressie. Als de volgorde van excisie wordt omgekeerd, van de laatste in hele planten studies, tot de eerste in de losgekoppelde studie, wordt het Voer experiment vereenvoudigd.
Solanum tuberosum var. Kennebec wordt door Nodale Transfer in een eenvoudig weefselkweek medium vermeerderd en naar de bodem overgebracht voor verdere groei indien gewenst. De bladeren worden uit de moederplant weggesneden en naar Petri schalen verplaatst waar de voedings test wordt uitgevoerd met de larvale stadia van M. sexta. Beschadigd blad weefsel wordt getest voor de expressie van relatief vroege gebeurtenissen in signaaltransductie. Genexpressie analyse identificeerde infestatie-specifieke Cys2-His2 (C2H2) transcriptiefactoren, ter bevestiging van het succes van het gebruik van losgekoppelde bladeren in vroege respons studies. De methode is gemakkelijker uit te voeren dan hele planten besmettingen en gebruikt minder ruimte.
Introduction
Herbivory zet een reeks moleculaire gebeurtenissen in gang waarbij een plant zowel de aanval kan identificeren als een passende respons voor zijn overleving aankoppelt. Een plant krijgt twee basis aanwijzingen van vretende insecten; een van de fysieke schade aan het weefsel en de andere van insecten-specifieke stoffen. Schade-geassocieerde moleculaire patronen (DAMPs) worden vrijgegeven in reactie op schade door larvale mondstukken en leiden tot een goed gedefinieerde wond respons die resulteert in een toename van het hormoon jasmonic zuur en de transcriptie van Defense genen1. Een van de bekendste Damps is systemIn, een polypeptide dat wordt gevormd door het decolleté van het grotere prosystemine eiwit nadat een blad is verwond2,3. De reactie van jasmonic acid wond wordt verder gemoduleerd door herbivore-geassocieerde moleculaire patronen (HAMPs), die kunnen worden afgeleid van Caterpillar speeksel, darminhoud (regurgitant) en ontlasting (frass)4. Insecten gebruiken deze stoffen om de afweerreactie5te stimuleren of te omzeilen. Transcriptiefactoren dan de boodschap doorgeven van hormoon signalen in de verdediging reactie via regulering van downstream verdediging genen6,7,8.
Sommige planten-insecten interactiestudies gebruikt in laboratorium instellingen zijn van het gesimuleerde type, met een doelstelling van de benadering van de natuurlijke methode van het voeden door het insect. Gesimuleerde ivoren wordt meestal bereikt door het creëren van kunstmatige schade aan plantenweefsels met verschillende gereedschappen die het specifieke mechanisme van insecten mondstukken voldoende nabootsen om de vrijlating van Damps te veroorzaken en de productie van verdedigings genen te triggeren. Andere insectenspecifieke componenten zoals orale afscheidingen of regurgitant worden vaak toegevoegd om de bijdrage van hamps9,10,11te repliceren. Het creëren van een specifieke grootte en type wond en de toepassing van precieze hoeveelheden HAMPs is een voordeel voor dit soort studies en kan meer reproduceerbare resultaten bieden. Natuurlijke ivoren studies, waarbij beschadiging van het plantenweefsel wordt bewerkstelligd door de toepassing van in het veld verworven of door laboratoria opgefokt insecten, zijn vaak uitdagender, omdat de bedragen van wond grootte en Hamp worden beheerst door insecten gedrag en variabiliteit toevoegen aan de Gegevens. De natuurlijke versus gesimuleerde methoden en hun voor-en nadelen zijn goed besproken in de literatuur12,13,14.
Om vroege signalering van gebeurtenissen zoals transcriptiefactoren te bestuderen, moet een bepaald percentage van het blad in relatief korte tijd worden verbruikt, dus larven moeten onmiddellijk beginnen te kauwen en het verbruik behouden totdat het blad is bevroren voor analyse. M. sexta is een vraatzuchtige feeder op meerdere nachtschadeachtigen planten tijdens veel van zijn larvale stadia, waardoor het ideaal is voor het impareren van maximale schade in relatief korte tijd15. Dit is handig bij het bestuderen van vroege signalering van gebeurtenissen, als de reactie van de plant komt bijna onmiddellijk na een insect contact op met het blad oppervlak16,17. De veelgebruikte clip Cage-methode van containment bewijst onhandig, omdat meerdere kooien tijdens het experiment voortdurend moeten worden aangepast om de verwijdering of toevoeging van larven mogelijk te maken. De bladeren moeten ook groot genoeg en sterk genoeg zijn om meerdere insecten voeden tegelijkertijd te ondersteunen. Deze soorten aardappelplanten vereisen een grote hoeveelheid ruimte om de voeding te observeren. Larven zullen vaak naar de onderzijde van het bladoppervlak verhuizen, wat het voeren van waarnemingen ook heel moeilijk maakt. Het gebruik van hele planten om deze experimenten uit te voeren is duidelijk omslachtig.
De huidige studie maakt gebruik van losstaande bladeren geïsoleerd in Petri schalen in plaats van hele planten te stroomlijnen en vereenvoudigen van de hele plant aanpak voor het bestuderen van herbivory. De toepassing van het protocol in deze studie is beperkt tot de waarneming van een groep van C2H2 transcriptiefactoren die vroeg in aardappel bladeren zijn geïnduceerd na herbivante schade door M. sexta larven.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gebruik van bestaande volledige plantenherbivory methodieken is niet nodig om het doel van deze specifieke studie te bereiken (d.w.z. een reeks kandidaatgenen te schermen voor hun reactie op besmetting). Het voor de hand liggende voordeel van de vrijstaande blad verfijning is het verkorten van de tijd die het kost om ivoren assays uit te voeren. De onhandige aard van hele planten met clip kooien wordt geëlimineerd en assays worden eerder uitgevoerd, omdat planten zo jong als 2 weken kunnen worden gebruikt om bladere…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Bob Farrar en Alexis Park bedanken voor het leveren van insecten die in deze studie worden gebruikt en voor hun expertise in larvale staging. Extra dank aan Michael Blackburn en Saikat Ghosh voor kritische recensie van het manuscript.
Vermelding van handelsnamen of commerciële producten in deze publicatie is uitsluitend bedoeld om specifieke informatie te verstrekken en impliceert geen aanbeveling of goedkeuring door het Amerikaanse ministerie van landbouw.
USDA is een aanbieder van gelijke kansen en werkgever.
Materials
| agar substitute | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | product is Gelzan |
| containment vessel (6,12 or 24 well dish) | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | many other companies sell these products |
| manduca eggs | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30-50 eggs |
| manduca eggs | Great Lakes Hornworm | NA | 50, 100, 250 or 500 eggs |
| manduca larvae | Carolina Biological Supply Company | call for specific larval instar requests | any instar |
| manduca larvae | Great Lakes Hornworm | call for specific larval instar requests | any instar |
| microcentrifuge tubes, 1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | these have been tested in liquid N2 and will not explode |
| Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins | PhytoTechnology Laboratories | M519 | used to make propagation medium |
| nutrient agar mix | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan |
| paper filter discs | Fisher Scientific | 09-805A | Whatman circles-purchase to fit in petri dish |
| petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A or FB0875712 | purchase size appropriate for leaf size |
| potato tubers | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| pots, 10" | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| preservative/biocide | Plant Cell Technology | NA | product is PPM (Plant Preservative Mixture) |
| seed potatoes for explant source | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| slow release fertilizer (14-14-14 ) | any | NA | Osmocote is a popular brand name |
| soft touch forceps | BioQuip | 4750 | |
| soil mix | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | product is Sunshine LC1 mix |
| sterile culture vessel | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Magenta-type vessel, PTL-100 |
| sterile culture vessel | Fisher Scientific | ICN2672206 | product is MP Biomedicals Plantcon |
References
- Choi, H. W., Klessig, D. F. DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity. BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).
- Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins. Science. 253, 895-897 (1991).
- Savatin, D. V., Gramegna, G., Modesti, V., Cervone, F. Wounding in the plant tissue: the defense of a dangerous passage. Frontiers in Plant Science. 470 (5), 1-11 (2014).
- Basu, S., Varsanit, S., Louis, J. Altering Plant Defenses: Herbivore-Associated Molecular Patterns and Effector Arsenal of Chewing Herbivores. Molecular Plant-Microbe Interactions. 31, 13-21 (2018).
- Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110, 15728-15733 (2013).
- Chen, M. -. S. Inducible direct plant defense against insect herbivores: A review. Insect Science. 15, 101-114 (2008).
- Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in jasmonate signaling for multistress resilience. Annual Review of Plant Biology. 69, 387-415 (2018).
- War, A. R., et al. Plant defence against herbivory and insect adaptations. AoB PLANTS. 10 (4), 1-19 (2018).
- McCloud, E. S., Baldwin, I. T. Herbivory and caterpillar regurgitants amplify the wound-induced increases in jasmonic acid but not nicotine in Nicotiana sylvestris. Planta. 203, 430-435 (1997).
- Schittko, U., Hermsmeier, D., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate: II. Accumulation of plant mRNAs responding to insect-derived cues. Plant Physiology. , 701-710 (2001).
- Halitschke, R., Schittko, U., Pohnert, G., Boland, W., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate. III. Fatty acid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient for herbivore-specific plant responses. Plant Physiology. 125, 711-717 (2001).
- Lortzing, T., et al. Transcriptomic responses of Solanum dulcamara to natural and simulated herbivory. Molecular Ecology Resources. 17, 1-16 (2017).
- Hjältén, J. Simulating herbivory: problems and possibilities. Ecological Studies. 173, 243-255 (2004).
- Lehtilä, K., Boalt, E. The use and usefulness of artificial herbivory in plant-herbivore studies. Ecological Studies. 173, 257-275 (2004).
- Schittko, U., Preston, C. A., Baldwin, I. T. Eating the evidence? Manduca sexta larvae can not disrupt specific jasmonate induction in Nicotiana attenuata by rapid consumption. Planta. 210, 343-346 (2000).
- Zebelo, S. A., Maffei, M. E. Role of early signalling events in plant-insect interactions. Journal of Experimental Botany. 66, 435-448 (2015).
- Maffei, M. E., Mithofer, A., Boland, W. Before gene expression: early events in plant-insect interaction. Trends in Plant Science. 12, 310-316 (2007).
- Goodwin, P. B., Adisarwanto, T. Propagation of potato by shoot tip culture in Petri dishes. Potato Research. 23, 445-448 (1980).
- Goodwin, P. B. Rapid propagation of potato by single node cuttings. Field Crops Research. 4, 165-173 (1981).
- Martin, P. A. W., Blackburn, M. B. Using combinatorics to screen Bacillus thuringiensis isolates for toxicity against Manduca sexta and Plutella xylostella. Biological Control. 42, 226-232 (2007).
- Bell, R. A., Joachim, F. G. Techniques for rearing laboratory colonies of tobacco hornworms and pink bollworms. Annals of the Entomological Society of America. 69 (2), 365-373 (1976).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G. The remarkable plethora of infestation-responsive Q-type C2H2 transcription factors in potato. BMC Research Notes. 11, 1-7 (2018).
- Green, J. M., et al. PhenoPhyte: a flexible affordable method to quantify 2D phenotypes from imagery. Plant Methods. 8 (45), 1-12 (2012).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G., Jones, R. W., Farrar, R. R., Blackburn, M. B. Herbivory responsive C2H2 zinc finger transcription factor protein StZFP2 from potato. Plant Physiology and Biochemistry. 80, 226-233 (2014).
- Korth, K. L., Dixon, R. A. Evidence for chewing insect-specific molecular events distinct from a general wound response in leaves. Plant Physiology. 115, 1299-1305 (1997).
- Browne, R. A., Cooke, B. M. Development and evaluation of an in vitro detached leaf assay for pre-screening resistance to Fusarium head blight in wheat. European Journal of Plant Pathology. 110, 91-102 (2004).
- Browne, R. A., et al. Evaluation of components of fusarium head blight resistance in soft red winter wheat germ plasm using a detached leaf assay. Plant Disease. 89, 404-411 (2005).
- Michel, A. P., Rouf Mian, M. A., Davila-Olivas, N. H., Canas, L. A. Detached leaf and whole plant assays for soybean aphid resistance: differential responses among resistance sources and biotypes. Journal of Economic Entomology. 103, 949-957 (2010).
- Sharma, H. C., Pampapathy, G., Dhillon, M. K., Ridsdill-Smith, J. T. Detached leaf assay to screen for host plant resistance to Helicoverpa armigera. Journal of Economic Entomology. 98, 568-576 (2005).
- Vivianne, G. A. A., et al. A laboratory assay for Phytophthora infestans resistance in various Solanum species reflects the field situation. European Journal of Plant Pathology. 105, 241-250 (1999).
- Kamoun, S., et al. A gene encoding a protein elicitor of Phytophthora infestans is down-regulated during infection of potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 10, 13-20 (1997).
- Nowakowska, M., Nowicki, M., Kłosińska, U., Maciorowski, R., Kozik, E. U. Appraisal of artificial screening techniques of tomato to accurately reflect field performance of the Late Blight resistance. Plos One. 9, e109328 (2014).
- Arimura, G., et al. Herbivory-induced volatiles elicit defence genes in lima bean leaves. Nature. 406, 512-515 (2000).
- Erb, M. Volatiles as inducers and suppressors of plant defense and immunity-origins, specificity, perception and signaling. Current Opinion in Plant Biology. 44, 117-121 (2018).
- Hasegawa, S., et al. Gene expression analysis of wounding-induced root-to-shoot communication in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell and Environment. 34, 705-716 (2011).
- Ryan, C. A., Moura, D. S. Systemic wound signaling in plants: A new perception. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 6519-6520 (2002).
- Hilleary, R., Gilroy, S. Systemic signaling in response to wounding and pathogens. Current Opinion in Plant Biology. 43, 57-62 (2018).
- . Hornworms Available from: https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr (2018)
- . Products Available from: https://www.greatlakeshornworm.com/products/ (2018)
- . Raising Manduca sexta Available from: https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html (2018)
- . Teach life cycles with the tobacco hornworm Available from: https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr (2018)
- Chung, S. H., et al. Host plant species determines symbiotic bacterial community mediating suppression of plant defenses. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
