Freistehende Leaf Assays zur Vereinfachung der Genexpressionsstudien in Kartoffeln während des Befalls durch Kauen Voninsekt Manduca sexta
Summary
Die vorgestellte Methode schafft natürliches Pflanzenfresser schädigendes Pflanzengewebe durch die Anwendung von Manduca sexta Larven auf abgetrennte Blätter von Kartoffeln. Das Pflanzengewebe wird auf die Expression von sechs Transkriptionsfaktor-Homologen geprüft, die an frühen Reaktionen auf Insektenkraut beteiligt sind.
Abstract
Die multitrophische Natur von Genexpressionsstudien von Insektenkraut erfordert eine große Anzahl biologischer Replizieren, wodurch einfachere, schlankere Kräuterschutzprotokolle erforderlich sind. Störungen von Kauinsekten werden in der Regel in ganzen Pflanzensystemen untersucht. Während diese ganze Organismus-Strategie beliebt ist, ist es nicht notwendig, wenn ähnliche Beobachtungen in einem einzigen abgetrennten Blatt repliziert werden können. Es wird davon ausgegangen, dass die für die Signaltransduktion erforderlichen Grundelemente innerhalb des Blattes selbst vorhanden sind. Bei frühen Ereignissen in der Signaltransduktion müssen Zellen nur das Signal von der Störung empfangen und an benachbarte Zellen übertragen, die auf Genexpression untersucht werden.
Die vorgeschlagene Methode ändert lediglich den Zeitpunkt der Ablösung. In ganzen Pflanzenexperimenten sind Larven auf ein einzelnes Blatt beschränkt, das schließlich von der Pflanze gelöst und auf Genexpression untersucht wird. Wenn die Reihenfolge der Exzision umgekehrt wird, von der letzten in ganzen Pflanzenstudien, auf den ersten in der freistehenden Studie, wird das Fütterungsexperiment vereinfacht.
Solanum tuberosum var. Kennebec wird durch Knotentransfer in einem einfachen Gewebekulturmedium vermehrt und auf Wunsch auf den Boden übertragen. Die Blätter werden von der Mutterpflanze entfernt und in Petrischalen verlegt, wo der Fütterungstest mit den Larvenstadien von M. sextadurchgeführt wird. Beschädigtes Blattgewebe wird auf die Expression relativ früher Ereignisse in der Signaltransduktion geprüft. Die Genexpressionsanalyse identifizierte befallspezifische Cys2-His2 (C2H2)-Transkriptionsfaktoren, was den Erfolg der Verwendung von freistehenden Blättern in frühen Reaktionsstudien bestätigte. Die Methode ist einfacher durchzuführen als ganze Pflanzenbefall und verbraucht weniger Platz.
Introduction
Herbivory setzt eine Reihe molekularer Ereignisse in Gang, bei denen eine Pflanze sowohl den Angriff identifizieren als auch eine angemessene Reaktion auf ihr Überleben montieren kann. Eine Pflanze erhält zwei grundlegende Hinweise von kauenden Insekten; eine durch die physische Schädigung des Gewebes und die andere durch insektenspezifische Substanzen. Schadensassoziierte molekulare Muster (DAMPs) werden als Reaktion auf Schäden freigesetzt, die durch Larvenmspiele verursacht werden, und lösen eine klar definierte Wundreaktion aus, die zu einer Erhöhung des Hormons Jasmonsäure und der Transkription der Verteidigungsgene1führt. Eines der bekanntesten DAMPs ist systemin, ein Polypeptid, das durch die Spaltung des größeren Prosystemin-Proteins gebildet wird, nachdem ein Blatt 2,3verwundet wurde. Die Jasmonsäure-Wundreaktion wird durch pflanzenfressende molekulare Muster (HAMPs) weiter moduliert, die aus Raupenspeichel, Darminhalt (regurgitant) und Kot (frass) abgeleitet werden können4. Insekten verwenden diese Substanzen, um entweder die Abwehrzuwehr zu steigern oder zu umgehen5. Transkriptionsfaktoren leiten dann die Botschaft von Hormonsignalen in der Abwehrreaktion über die Regulierung der nachgeschalteten Abwehrgene6,7,8weiter.
Einige Pflanzen-Insekten-Interaktionsstudien, die in Laborumgebungen verwendet werden, sind vom simulierten Typ, mit dem Ziel, die natürliche Methode der Fütterung durch das Insekt zu annähernden. Simuliertes Krautwird wird in der Regel durch die Schaffung künstlicher Schäden an Pflanzengeweben mit verschiedenen Werkzeugen erreicht, die den spezifischen Mechanismus von Insektenmundteilen imitieren, die ausreichen, um die Freisetzung von DAMPs zu verursachen und die Produktion von Verteidigungsgenen auszulösen. Andere insektenspezifische Komponenten wie mundende Sekrete oder Regurgitant werden oft hinzugefügt, um den Beitrag von HAMPs9,10,11zu replizieren. Die Erstellung einer bestimmten Größe und Art der Wunde und die Anwendung präziser Mengen an HAMPs ist ein Vorteil für diese Arten von Studien und kann reproduzierbarere Ergebnisse liefern. Natürliche Pflanzenschutzstudien, bei denen Schäden am Pflanzengewebe durch die Anwendung von felderworbenen oder im Labor gezüchteten Insekten durchgeführt werden, sind oft schwieriger, da Wundgrößen- und HAMP-Mengen durch Insektenverhalten bestimmt werden und die Variabilität der daten. Die natürlichen versus simulierten Methoden und ihre Vor- und Nachteile sind in der Literatur gut diskutiert12,13,14.
Um frühe Signalereignisse wie Transkriptionsfaktoren zu untersuchen, muss ein bestimmter Prozentsatz des Blattes in relativ kurzer Zeit verbraucht werden, so dass Larven sofort zu kauen beginnen und den Verbrauch aufrecht erhalten müssen, bis das Blatt zur Analyse eingefroren ist. M. sexta ist ein gefräßiger Feeder auf mehreren solanaceous Pflanzen während vieler seiner Larvenstadien, so dass es ideal für die Vermittlung von maximalen Schaden in einer relativ kurzen Zeit15. Dies ist praktisch, wenn frühe Signalereignisse untersucht werden, da die Reaktion der Pflanze fast unmittelbar nach einem Insektenkontakt mit der Blattoberfläche16,17auftritt. Die häufig verwendete Clip-Käfig-Methode der Einschließung erweist sich als ungeschickt, da mehrere Käfige während des gesamten Experiments kontinuierliche Anpassungen erfordern würden, um die Entfernung oder Zugabe von Larven zu ermöglichen. Die Blätter müssen auch groß genug und stark genug sein, um mehrere Insekten zu unterstützen, die gleichzeitig füttern. Diese Arten von Kartoffelpflanzen benötigen viel Platz, um die Fütterung zu beobachten. Larven werden oft an die Unterseite der Blattoberfläche verlagert, was auch Fütterungsbeobachtungen recht schwierig macht. Ganze Pflanzen zu verwenden, um diese Experimente durchzuführen, ist eindeutig umständlich.
Die aktuelle Studie verwendet freistehende Blätter, die in Petrischalen isoliert sind, anstatt ganze Pflanzen, um den gesamten Pflanzenansatz für das Studium von Kräutern zu rationalisieren und zu vereinfachen. Die Anwendung des Protokolls in dieser Studie beschränkt sich auf die Beobachtung einer Gruppe von C2H2-Transkriptionsfaktoren, die früh in Kartoffelblättern nach pflanzenfressenden Schäden durch M. sexta Larven induziert wurden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Verwendung bestehender Methoden für pflanzenkräuterelfenbeinte Pflanzen ist nicht erforderlich, um das Ziel dieser speziellen Studie zu erreichen (d. h. eine Reihe von Kandidatengenen auf ihre Reaktion auf Densonfall zu untersuchen). Der offensichtliche Vorteil der losgelösten Blattverfeinerung ist die Verkürzung der Zeit, die es braucht, um Kräuter-Assays durchzuführen. Die sperrige Natur ganzer Pflanzen mit Clipkäfigen wird eliminiert und Tests werden früher durchgeführt, da Pflanzen, die noch 2 Wochen alt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Bob Farrar und Alexis Park für die Bereitstellung von Insekten, die in dieser Studie verwendet werden, und für ihre Expertise in der Larveninszenierung. Weiterer Dank an Michael Blackburn und Saikat Ghosh für die kritische Überprüfung des Manuskripts.
Die Erwähnung von Handelsnamen oder kommerziellen Produkten in dieser Veröffentlichung dient ausschließlich der Bereitstellung spezifischer Informationen und impliziert keine Empfehlung oder Billigung durch das US-Landwirtschaftsministerium.
USDA ist Ein Anbieter von Chancengleichheit und Arbeitgeber.
Materials
| agar substitute | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | product is Gelzan |
| containment vessel (6,12 or 24 well dish) | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | many other companies sell these products |
| manduca eggs | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30-50 eggs |
| manduca eggs | Great Lakes Hornworm | NA | 50, 100, 250 or 500 eggs |
| manduca larvae | Carolina Biological Supply Company | call for specific larval instar requests | any instar |
| manduca larvae | Great Lakes Hornworm | call for specific larval instar requests | any instar |
| microcentrifuge tubes, 1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | these have been tested in liquid N2 and will not explode |
| Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins | PhytoTechnology Laboratories | M519 | used to make propagation medium |
| nutrient agar mix | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan |
| paper filter discs | Fisher Scientific | 09-805A | Whatman circles-purchase to fit in petri dish |
| petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A or FB0875712 | purchase size appropriate for leaf size |
| potato tubers | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| pots, 10" | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| preservative/biocide | Plant Cell Technology | NA | product is PPM (Plant Preservative Mixture) |
| seed potatoes for explant source | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| slow release fertilizer (14-14-14 ) | any | NA | Osmocote is a popular brand name |
| soft touch forceps | BioQuip | 4750 | |
| soil mix | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | product is Sunshine LC1 mix |
| sterile culture vessel | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Magenta-type vessel, PTL-100 |
| sterile culture vessel | Fisher Scientific | ICN2672206 | product is MP Biomedicals Plantcon |
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