Des essais de feuilles détachées pour simplifier les études sur l'expression génique de la pomme de terre pendant l'infestation par l'insecte à mâcher Manduca sexta
Summary
La méthode présentée crée des tissus végétaux naturels endommagés par l’herbivore grâce à l’application de larves de sexta de Manduca sur des feuilles détachées de pommes de terre. Le tissu végétal est mis en ligne pour l’expression de six homologs de facteur de transcription impliqués dans les réponses précoces à l’herbivorie d’insecte.
Abstract
La nature multitrophique des études d’expression génique de l’herbivorie d’insecte exige un grand nombre de répliques biologiques, créant la nécessité de protocoles d’herbivorie plus simples et plus rationalisés. Les perturbations des insectes à mâcher sont généralement étudiées dans des systèmes végétaux entiers. Bien que cette stratégie de l’organisme entier soit populaire, il n’est pas nécessaire que des observations similaires puissent être reproduites en une seule feuille détachée. L’hypothèse est que les éléments de base requis pour la transduction du signal sont présents dans la feuille elle-même. Dans le cas d’événements précoces dans la transduction du signal, les cellules n’ont qu’à recevoir le signal de la perturbation et à transmettre ce signal aux cellules voisines qui sont astoyées pour l’expression des gènes.
La méthode proposée change simplement le moment du détachement. Dans des expériences végétales entières, les larves sont confinées à une seule feuille qui est finalement détachée de la plante et aventurée pour l’expression des gènes. Si l’ordre d’excision est inversé, de la dernière dans des études végétales entières, à la première dans l’étude détachée, l’expérience d’alimentation est simplifiée.
Solanum tuberosum var. Kennebec est propagé par transfert nodal dans un milieu de culture tissulaire simple et transféré au sol pour une croissance ultérieure si désiré. Les feuilles sont excisées de la plante mère et relocalisées dans les plats Petri où l’alimentation est effectuée avec les stades larvaires de M. sexta. Le tissu foliaire endommagé est mis en ligne pour l’expression d’événements relativement précoces dans la transduction du signal. L’analyse de l’expression génique a permis d’identifier des facteurs de transcription Cys2-His2 (C2H2) spécifiques à l’infestation, confirmant le succès de l’utilisation de feuilles détachées dans les études de réponse précoce. La méthode est plus facile à exécuter que les infestations de plantes entières et utilise moins d’espace.
Introduction
Herbivory met en branle une série d’événements moléculaires au cours desquels une plante peut à la fois identifier l’attaque et monter une réponse appropriée pour sa survie. Une plante reçoit deux indices de base des insectes à mâcher; l’un des dommages physiques au tissu et l’autre de substances spécifiques aux insectes. Les modèles moléculaires associés aux dommages (DAMP) sont libérés en réponse aux dommages créés par les parties buccales larvaires etdéclenchent une réponse bien définie de blessure qui a comme conséquence une augmentation de l’acide jasmonique d’hormone et de la transcription des gènes de défense 1. L’un des DAMP les plus connus est la systemine, un polypeptide qui est formé par le clivage de la protéine prosystemine plus grande après une feuille est blessée2,3. La réponse de blessure d’acide jasmonique est encore modulée par des modèles moléculaires herbivore-associés (HAMPs), qui peuventêtre dérivés de la salive de chenille, du contenu d’intestin (régurgitant) et des excréments (frass) 4. Les insectes utilisent ces substances pour stimuler ou échapper à la réponse de la défense5. Les facteurs de transcription relaient alors le message des signaux hormonaux dans la réponse de défense par la régulation des gènes de défense en aval6,7,8.
Certaines études d’interaction plante-insectes utilisées en laboratoire sont du type simulé, dans le but d’approxirér la méthode naturelle d’alimentation de l’insecte. L’herbivorie simulée est généralement accomplie en créant des dommages artificiels aux tissus végétaux avec divers outils qui imitent le mécanisme spécifique des parties buccales d’insecte suffisantes pour causer la libération des DAMP et déclencher la production des gènes de défense. D’autres composants spécifiques aux insectes tels que les sécrétions orales ou régurgitants sont souvent ajoutés pour reproduire la contribution des HAMPs9,10,11. La création d’une taille et d’un type de plaies spécifiques et l’application de quantités précises de HAMP est un avantage pour ces types d’études et peuvent offrir des résultats plus reproductibles. Les études d’herbivorie naturelle, où les dommages aux tissus végétaux sont causés par l’application d’insectes acquis sur le terrain ou élevés en laboratoire, sont souvent plus difficiles parce que les quantités de plaies et de HAMP sont régies par le comportement des insectes et ajoutent de la variabilité à la données. Les méthodes naturelles par rapport aux méthodes simulées et leurs avantages et inconvénients sont bien débattus dans la littérature12,13,14.
Pour étudier les événements de signalisation précoce tels que les facteurs de transcription, un certain pourcentage de la feuille doit être consommé dans un laps de temps relativement court, de sorte que les larves doivent commencer à mâcher immédiatement et maintenir la consommation jusqu’à ce que la feuille soit congelée pour analyse. M. sexta est une mangeoire vorace sur plusieurs plantes solitaires au cours de plusieurs de ses stades larvaires, ce qui le rend idéal pour donner un maximum de dommages dans un laps de temps relativement court15. Ceci est pratique lors de l’étude des événements de signalisation précoce, comme la réponse de la plante se produit presque immédiatement après un insecte entre en contact avec la surface de la feuille16,17. La méthode de confinement couramment utilisée par la cage à agrafes s’avère maladroite, car plusieurs cages nécessiteraient des ajustements continus tout au long de l’expérience pour permettre l’enlèvement ou l’ajout de larves. Les feuilles doivent également être assez grandes et assez fortes pour supporter l’alimentation de plusieurs insectes en même temps. Ces types de plants de pommes de terre ont besoin d’une grande quantité d’espace pour observer l’alimentation. Les larves se déplacent souvent vers le dessous de la surface des feuilles, ce qui rend également les observations d’alimentation assez difficiles. L’utilisation de plantes entières pour effectuer ces expériences est clairement lourde.
L’étude actuelle utilise des feuilles détachées isolées dans les plats Petri plutôt que des plantes entières pour rationaliser et simplifier l’approche végétale entière à l’étude de l’herbivorie. L’application du protocole dans cette étude se limite à l’observation d’un groupe de facteurs de transcription C2H2 induits tôt dans les feuilles de pomme de terre après des dommages herbivores par les larves de M. sexta.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’utilisation de méthodes d’herbivorie végétale s’enclenchent ensemble n’est pas nécessaire pour atteindre l’objectif de cette étude particulière (c.-à-d. examiner un ensemble de gènes candidats pour leur réponse à l’infestation). L’avantage évident du raffinement détaché de feuille est de raccourcir le temps qu’il prend pour effectuer des essais d’herbivorie. La nature lourde des plantes entières avec des cages à clip est éliminée et les essais sont effectués plus tôt, puisque des plantes aussi jeunes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tenons à remercier Bob Farrar et Alexis Park d’avoir fourni des insectes utilisés dans cette étude et de leur expertise dans la mise en scène larvaire. Merci également à Michael Blackburn et Saikat Ghosh pour l’examen critique du manuscrit.
La mention des noms commerciaux ou des produits commerciaux dans cette publication vise uniquement à fournir des renseignements précis et n’implique pas de recommandation ou d’approbation par le ministère de l’Agriculture des États-Unis.
L’USDA est un fournisseur et un employeur de l’égalité des chances.
Materials
| agar substitute | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | product is Gelzan |
| containment vessel (6,12 or 24 well dish) | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | many other companies sell these products |
| manduca eggs | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30-50 eggs |
| manduca eggs | Great Lakes Hornworm | NA | 50, 100, 250 or 500 eggs |
| manduca larvae | Carolina Biological Supply Company | call for specific larval instar requests | any instar |
| manduca larvae | Great Lakes Hornworm | call for specific larval instar requests | any instar |
| microcentrifuge tubes, 1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | these have been tested in liquid N2 and will not explode |
| Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins | PhytoTechnology Laboratories | M519 | used to make propagation medium |
| nutrient agar mix | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan |
| paper filter discs | Fisher Scientific | 09-805A | Whatman circles-purchase to fit in petri dish |
| petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A or FB0875712 | purchase size appropriate for leaf size |
| potato tubers | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| pots, 10" | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| preservative/biocide | Plant Cell Technology | NA | product is PPM (Plant Preservative Mixture) |
| seed potatoes for explant source | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| slow release fertilizer (14-14-14 ) | any | NA | Osmocote is a popular brand name |
| soft touch forceps | BioQuip | 4750 | |
| soil mix | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | product is Sunshine LC1 mix |
| sterile culture vessel | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Magenta-type vessel, PTL-100 |
| sterile culture vessel | Fisher Scientific | ICN2672206 | product is MP Biomedicals Plantcon |
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