Effet des anticorps Anti-c-fms sur la Formation des ostéoclastes et la prolifération des précurseurs des ostéoclastes In Vitro
Summary
Ce protocole comprend la dissection de murin des os longs et l’isolement de la moelle osseuse, pour générer des macrophages de la moelle osseuse et de produire des ostéoclastes à l’aide de la colonie de macrophages stimulant facteur (M-CSF) et activateur du récepteur du ligand facteur nucléaire Kappa-B (RANKL) ou facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) et leur arrestation par des anticorps anti-c-fms, récepteurs de M-CSF.
Abstract
Remodelage osseux est un processus complexe et implique des périodes de dépôt et de résorption. La résorption osseuse est un processus par lequel osseuse est décomposé par les ostéoclastes en réponse à différents stimuli. Précurseurs ostéoclastiques se différencient en ostéoclastes multinucléaires en réponse à la colonie de macrophages stimulant facteur (M-CSF) et activateur du récepteur du ligand facteur nucléaire Kappa-B (RANKL). Dans des conditions pathologiques, le profil des cytokines est différent et implique un mélange des cytokines inflammatoires. Facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) est l’un des cytokines plus importants que l’on retrouve en grande quantité dans les zones concernées avec ostéolyse inflammatoire. Le but du présent protocole est de fournir une méthode par laquelle murin de moelle osseuse est isolé pour générer les ostéoclastes par induction avec M-CSF et RANKL ou TNF-α, qui est inhibée par la suite en augmentant les doses d’anticorps anti-c-fms, le récepteur pour M-CSF. Cette expérience met en évidence la valeur thérapeutique des anticorps anti-c-fms dans les maladies inflammatoires de la résorption osseuse.
Introduction
Les ostéoclastes sont des cellules très spécialisées, et ils se différencient des cellules souches hématopoïétiques par la fusion de plusieurs précurseurs ostéoclastiques. Ils sont essentiels pour le remodelage osseux sain et contribuent à la résorption osseuse pathologique associée à des maladies ostéolytiques inflammatoires comme l’arthrite rhumatoïde et la maladie parodontale1.
Fonction Osteoclastogenesis et ostéoclastes sont médiés par deux facteurs clés ; macrophages stimulant les colonies facteur (M-CSF) et activateur du récepteur du ligand de facteur nucléaire kappa-B (RANKL). M-CSF tant RANKL sont importants pour de différenciation ostéoclastique2. Un autre facteur qui a été montré pour induire la formation des ostéoclastes de macrophages de la moelle osseuse in vitro est le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α)3,4,5. TNF-α ostéoclastique médiée par la formation s’est avérée être crucial pour l’ostéolyse en maladies osseuses destructrices comme6de la polyarthrite rhumatoïde, la maladie parodontale7et l’ostéoporose postménopausique8.
C-fms est le récepteur membranaire de M-CSF et intervient dans son action. Le rôle de c-fms est bien documenté dans la littérature comme il a été démontré que l’administration d’un anticorps dirigé contre c-fms (anticorps anti-c-fms) complètement arrêtées osteoclastogenesis dans un modèle de l’arthrite ainsi que de TNF-α induite par les érosions osseuses tout en osteoclastogenesis lointain de l’articulation enflammée a été encore robuste9. L’administration d’anticorps anti-c-fms inhibe la résorption osseuse et de la formation d’ostéoclastes induite par le lipopolysaccharide (LPS) en souris cranienne10 aussi bien que dans la parodontite induite par LPS modèle11. En outre, les anticorps anti-c-fms inhibent résorption mécanique racine induite par le stress pendant la dent orthodontie mouvement12, ainsi que mouvement dentaire orthodontique et la résorption osseuse associée à dents orthodontique mouvement13.
M-CSF a été rapporté ont d’autres fonctions qui sont essentielles à la réponse immunitaire hôte. L’absence de M-CSF chez les souris op/op avec pneumonie bactérienne conduisent à l’augmentation de la charge bactérienne et de la diffusion bactérienne au foie avec nécrose hépatique14. Par conséquent, M-CSF est important pour une réponse immunologique dans la protection contre l’infection.
Cette étude démontre l’effet des anticorps anti-c-fms sur M-CSF et RANKL ou TNF-α a induit la formation d’ostéoclastes in vitro et M-CSF induit la prolifération des précurseurs ostéoclastiques. Ce protocole montre l’isolement des cellules de la moelle épinière murin des os longs et les étapes pour générer des macrophages de la moelle osseuse (BMM) qui sont considérés comme des précurseurs ostéoclastiques et d’induire la différenciation de BMM en ostéoclastes multinucléaires par deux méthodes ; RANKL ou TNF-α. Le protocole compare également l’arrestation d’osteoclastogenesis dans les deux méthodes à l’aide d’anticorps anti-c-fms.
Le processus par lequel la moelle osseuse est extrait et utilisée ultérieurement pour générer des précurseurs ostéoclastiques est fiable en produisant de grandes quantités de cultures d’ostéoclastes pure qui peuvent être utilisés dans de multiples applications en aval telles que le dépistage des drogues. L’utilisation de RANKL ou TNF-α pour induire l’osteoclastogenesis dans le présent protocole distingue osteoclastogenesis comme un processus physiologique (RANKL) d’osteoclastogenesis comme un processus pathologique (TNF-α), qui à son tour fournit deux procédures alternatives pour guider la décision, dont l’un est supérieur en ce qui concerne les réactifs à utiliser dans les applications en aval. Ce protocole prévoit également une méthode par laquelle nous pouvons déterminer une concentration appropriée d’anticorps anti-c-fms qui peut être utilisé sans danger pour des études ultérieures impliqués dans la résorption osseuse et maladies ostéolytiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, nous avons étudié l’effet des anticorps anti-c-fms sur la formation des ostéoclastes induite par le RANKL, formation des ostéoclastes induite par la TNF-α et prolifération des précurseurs des ostéoclastes induite par la M-CSF. Nous avons constaté que le montant effectif des anticorps anti-c-fms pour l’inhibition de l’osteoclastogenesis entre la formation des ostéoclastes induite par le RANKL, formation d’ostéoclastes induite de TNF-α et M-CSF-induit la prolifération des précurseur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par un JSPS KAKENHI don de la société japonaise pour la Promotion de la Science (n ° 16K 11776 à K., n ° 17K 17306 K. S., n ° 16K 20637 à K. K., n ° 16K 20636 à M. S., n ° 18K 09862 à I. M.).
Materials
| Anti-c-Fms antibody | AFS98, a rat monoclonal, antimurine, c-Fms antibody (IgG2a) | ||
| TNF-α | Recombinant murine TNF-α prepared in our laboratory. TNF-α cDNA fragment cloned by RT-PCR and cloned into a pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) to generate a GST-fusion protein. GST-TNF-α was expressed in Escherichia coli BL21 cells cells (Stratagene, La Jolla, CA). The cells were lysed under nondenaturing conditions and GST-TNF-α was purified over a glutathione-Sepharose column. GST was cleaved off by PreScission Protease (Amersham Biosciences) by manufacturer’s directions and was removed by a glutathione-Sepharose column. | ||
| RANKL | PEPROTECH | 315-11 | Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E.coli |
| M-CSF | Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14–12 cell line culture supernatant at 5X106 cells in a 10-cm suspension culture dish. | ||
| α-MEM | Wako | with L-Glutamine and phenol red | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | s1820-500 | Fetal Bovine Serum French Origin |
| Culture dish | Corning | 100 mm x 20 mm style dish | |
| 96-well plate | Thermofischer Scientific | Nun clon Delta surface | |
| Cell counting kit-8 | Dojindo, Kumamoto, Japan | ||
| Microplate reader | Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan | ||
| Cell strainer | Corning | 40 μm Nylon | |
| Centrifuge tube | Corning | 50 mL CentriStar cap | |
| Triton X-100 | Wako | Polyoxyethylene (10) Octyphenyl ether |
References
- Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss. Journal of Immunology Research. 2015, 281287 (2015).
- Teitelbaum, S. L. Bone resorption by osteoclasts. Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).
- Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts. Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4858-4864 (2000).
- Kobayashi, K., et al. Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction. Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 275-286 (2000).
- Kim, N., et al. Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis. Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 589-595 (2005).
- Redlich, K., et al. Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction. Journal of Clinical Investestigation. 110 (10), 1419-1427 (2002).
- Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor. Journal of Clinical Investestigation. 100 (6), 1557-1565 (1997).
- Zha, L., et al. TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).
- Kitaura, H., et al. M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3418-3427 (2005).
- Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64 (2), 219-227 (2012).
- Kimura, K., et al. An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model. Oral Diseases. 20 (3), 319-324 (2014).
- Kitaura, H., et al. An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice. Angle Orthodontist. 79 (5), 835-841 (2009).
- Kitaura, H., et al. An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement. Journal of Dental Research. 87 (4), 396-400 (2008).
- Bettina, A., et al. M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes. Journal of Immunology. 196 (12), 5047-5055 (2016).
- Dougall, W. C., et al. RANK is essential for osteoclast and lymph node development. Genes & Develpoment. 13 (18), 2412-2424 (1999).
- Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (12), 4828-4832 (1990).
- Yang, P. T., et al. Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 65 (12), 1671-1672 (2006).
- Takei, I., et al. High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints. The Journal of Rheumatology. 27 (4), 894-899 (2000).
