Efecto de anticuerpos Anti-c-fms en la formación de osteoclastos y la proliferación de precursores de osteoclastos In Vitro
Summary
Este protocolo incluye la disección de huesos largos murinos y aislamiento de médula ósea, macrófagos de médula ósea y producir osteoclastos con estimulante factor (M-CSF) y el receptor activador del ligando del factor nuclear Kappa B (RANKL) de colonias de macrófagos o factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y su detención por el anticuerpo anti-c-fms, receptor de M-CSF.
Abstract
Remodelamiento óseo es un proceso complejo e implica períodos de deposición y reabsorción. La resorción ósea es un proceso por el cual hueso se descompone por osteoclastos en respuesta a diversos estímulos. Precursores de osteoclastos se diferencian en osteoclastos multinuclear en respuesta a la colonia de macrófagos estimulando la factor (M-CSF) y el receptor activador del ligando del factor nuclear Kappa B (RANKL). En condiciones patológicas, el perfil de citoquinas es diferente y consiste en una mezcla de citoquinas inflamatorias. Factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) es una de las citoquinas más importantes ya que se encuentra en grandes cantidades en áreas involucradas con el osteolysis inflamatorio. El propósito de este protocolo es proporcionar un método por el cual médula ósea murina es aislada para generar osteoclastos a través de la inducción con el M-CSF y RANKL o TNF-α que se inhibirá posteriormente al aumentar la dosis de anticuerpo anti-c-fms, el receptor por M-CSF. Este experimento pone de relieve el valor terapéutico de los anticuerpos anti-c-fms en enfermedades de la resorción ósea inflamatoria.
Introduction
Los osteoclastos son células altamente especializadas, y se diferencian de las células madre hematopoyéticas a través de la fusión de varios precursores de osteoclastos. Son esenciales para la remodelación de hueso sano y contribuyen a la resorción del hueso patológico asociada con enfermedades osteolíticas inflamatorias como la artritis reumatoide y la enfermedad periodontal1.
Osteoclastogénesis y osteoclastos función es mediada por dos factores clave; macrófago colonia estimulante factor (M-CSF) y el receptor activador del ligando de factor nuclear kappa B (RANKL). M-CSF y RANKL son importantes para la diferenciación de los osteoclastos2. Otro factor que se ha demostrado para inducir la formación de osteoclastos de macrófagos de médula ósea in vitro es el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α)3,4,5. TNF-α mediada por osteoclastos formación ha demostrado ser crítica para osteólisis en enfermedades óseas destructivas como artritis reumatoide6,7de la enfermedad periodontal y osteoporosis postmenopáusica8.
C-fms es el receptor de membrana de M-CSF y media su acción. El papel de c-fms está bien documentado en la literatura como se ha demostrado que la administración de un anticuerpo contra c-fms (anticuerpo anti-c-fms) totalmente detenido osteoclastogénesis en un modelo de artritis así como en TNF-α inducida por erosiones del hueso mientras que osteoclastogénesis distante de la articulación inflamada estaba aún robusto9. Administración de anticuerpos anti-c-fms inhibe los osteoclastos formación y hueso la resorción inducida por lipopolisacárido (LPS) en ratón calvariae10 así como en la periodontitis inducida por LPS modelo11. Además, anticuerpos anti-c-fms inhiben resorción de la raíz provocada por el estrés mecánico durante de movimiento dental ortodóncico12, así como el movimiento dental ortodóncico y la resorción ósea asociada de movimiento ortodóntico del diente13.
M-CSF se ha divulgado para tener otras funciones que son esenciales para la respuesta inmune del huésped. La ausencia de M-CSF en ratones op/op con neumonía bacteriana conduce al aumento de la carga bacteriana y diseminación bacteriana al hígado con necrosis hepática14. Por lo tanto, M-CSF es importante para la respuesta inmunológica en la protección contra la infección.
Este estudio demuestra el efecto de anticuerpos anti-c-fms en el M-CSF y RANKL o TNF-α inducida por la formación de osteoclastos in vitro y M-CSF indujo proliferación de precursores de osteoclastos. Este protocolo demuestra el aislamiento de células de médula ósea murina de los huesos largos y los pasos para generar los macrófagos de la médula (BMM) que son considerados como precursores de los osteoclastos para inducir la diferenciación de BMM en osteoclastos multinuclear por dos métodos; RANKL o TNF-α. El protocolo también compara la detención de osteoclastogénesis en ambos métodos usando el anticuerpo anti-c-fms.
El proceso por el cual médula es extraída y utiliza posteriormente para generar precursores de osteoclastos es confiable en la producción de grandes cantidades de cultivos de osteoclastos pura que pueden ser utilizados en múltiples aplicaciones posteriores como las pruebas de drogas. El uso de RANKL o TNF-α para inducir osteoclastogénesis en este protocolo distingue osteoclastogénesis como un proceso fisiológico (RANKL) de osteoclastogénesis como un proceso patológico (TNF-α), que a su vez proporciona dos procedimientos alternativos para guiar la decisión de que uno es superior en cuanto a los reactivos a utilizar en aplicaciones posteriores. Este protocolo también proporciona un método por el cual podemos determinar una concentración adecuada de anticuerpos anti-c-fms que pueden utilizar con seguridad para estudios posteriores en la resorción ósea y enfermedades osteolíticas.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, investigamos el efecto de anticuerpos anti-c-fms en la formación de osteoclastos inducida por RANKL, formación de osteoclastos inducida por el TNF-α y proliferación de precursores de osteoclastos inducida por el M-CSF. Se encontró que la cantidad efectiva de anticuerpos anti-c-fms para la inhibición de la osteoclastogénesis entre formación de osteoclastos inducida por RANKL, TNF-α inducida por osteoclastos formación y M-CSF indujo proliferación de precursores de osteoclastos es diferente.
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por un KAKENHI JSPS becado por la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (no. 16K 11776 H. K., no. 17K 17306 a K. S., no. 16K 20637 a k. k K., no. 16K 20636 a M. S., no. 18K 09862 I. m.).
Materials
| Anti-c-Fms antibody | AFS98, a rat monoclonal, antimurine, c-Fms antibody (IgG2a) | ||
| TNF-α | Recombinant murine TNF-α prepared in our laboratory. TNF-α cDNA fragment cloned by RT-PCR and cloned into a pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) to generate a GST-fusion protein. GST-TNF-α was expressed in Escherichia coli BL21 cells cells (Stratagene, La Jolla, CA). The cells were lysed under nondenaturing conditions and GST-TNF-α was purified over a glutathione-Sepharose column. GST was cleaved off by PreScission Protease (Amersham Biosciences) by manufacturer’s directions and was removed by a glutathione-Sepharose column. | ||
| RANKL | PEPROTECH | 315-11 | Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E.coli |
| M-CSF | Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14–12 cell line culture supernatant at 5X106 cells in a 10-cm suspension culture dish. | ||
| α-MEM | Wako | with L-Glutamine and phenol red | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | s1820-500 | Fetal Bovine Serum French Origin |
| Culture dish | Corning | 100 mm x 20 mm style dish | |
| 96-well plate | Thermofischer Scientific | Nun clon Delta surface | |
| Cell counting kit-8 | Dojindo, Kumamoto, Japan | ||
| Microplate reader | Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan | ||
| Cell strainer | Corning | 40 μm Nylon | |
| Centrifuge tube | Corning | 50 mL CentriStar cap | |
| Triton X-100 | Wako | Polyoxyethylene (10) Octyphenyl ether |
References
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