破骨細胞形成と培養破骨細胞前駆体の増殖に及ぼす抗 c-fms 抗体
Summary
このプロトコルにはマウス長管骨および骨髄分離、骨髄のマクロファージを生成し、破骨細胞マクロファージコロニー刺激因子 (M-CSF) と核因子 κ B ligand (RANKL) の受容体活性化剤を使用するが含まれていますか腫瘍壊死因子 α (TNF-α) と M-CSF 受容体抗体抗 c fms によって彼らの逮捕。
Abstract
骨リモデリングは複雑なプロセスで、沈着と吸収の期間が含まれます。骨は、骨はさまざまな刺激への応答で破骨細胞によって分解プロセスです。破骨細胞前駆体は、マクロファージコロニー刺激因子 (M-CSF) と核因子 κ B ligand (RANKL) の受容体活性化に応えて核破骨細胞に分化します。病理学的条件下でサイトカイン プロファイルが異なっており、炎症性サイトカインの混合物が含まれます。腫瘍壊死因子 α (TNF-α) は、炎症性融解に関与する領域に大量にある最も重要なサイトカインの一つです。このプロトコルの目的は、M-CSF と RANKL や TNF α 受容体抗体抗 c fms の線量の増加によってその後抑制が誘導を介して破骨細胞を生成する、骨髄に分離された方法を提供するにはM-CSF。この実験では、炎症性骨吸収の疾患における抗 c fms 抗体の治療上の価値を強調表示されます。
Introduction
破骨細胞は専門性の高いセルであり、彼らは複数の破骨細胞前駆体の融合による造血幹細胞から区別します。彼らは健康な骨の改造のために不可欠であり、リウマチ性関節炎など歯周疾患1炎症性骨疾患に関連付けられている病的骨吸収に貢献。
破骨細胞形成と破骨細胞の機能は、2 つの重要要因によって仲介されます。マクロファージコロニー刺激因子 (M-CSF) と核因子 κ B ligand (RANKL) の受容体の活性化。M-CSF と RANKL は破骨細胞分化2にとって重要です。骨髄マクロファージからの破骨細胞形成を誘導するために示されているもう一つの要因は、腫瘍壊死因子アルファ (TNF-α)3,4,5です。TNF α を介した破骨細胞形成関節リウマチ6、歯周疾患7、閉経後骨粗鬆症8などの破壊的な骨の病気で骨溶解のために重要であることが示されています。
C fms M CSF の膜受容体で、その作用を仲介します。C fms の役割が、ことを示したこと、c-fms (抗 c-fms 抗体) 抗体の完全に関節炎モデルにおける破骨細胞形成を逮捕し同様管理 TNF-α 誘導しながら骨びらんと文献に記載されています破骨細胞形成遠い炎症関節からまだ堅牢な9歳だった。抗 c-fms 抗体の投与マウス研究10同様 LPS 誘導性歯周炎モデル11.のようにリポ多糖 (LPS) による破骨細胞形成と骨吸収を抑制また、抗 c-fms 抗体抑制中矯正歯の移動だけでなく、矯正学的歯の移動12、機械的応力誘起歯根と骨の矯正学的歯の移動13に関連付けられています。
M-CSF は、宿主の免疫応答に不可欠な他の機能が報告されています。Op/op 細菌性肺炎でマウスの M-CSF の不在14肝細胞壊死と肝臓に細菌の散布や細菌の負担の増加に します。したがって、M CSF は感染症からの保護に免疫応答のために重要です。
本研究は、TNF α や RANKL M CSF に及ぼす抗 c-fms 抗体による破骨細胞形成の in vitro および M CSF による破骨細胞前駆細胞の増殖を示します。このプロトコルは、長い骨と破骨細胞前駆細胞とみなされる骨髄マクロファージ (BMM) を生成し、2 BMM の多核破骨細胞への分化を誘導する手順からマウス骨髄細胞の分離を示しますメソッド;RANKL または TNF α。プロトコルはまた、抗 c-fms 抗体を使用して両方の方法で破骨細胞形成の逮捕を比較します。
骨髄を抽出し、その後破骨細胞前駆体を生成するために使用するプロセスは、薬物検査など複数のダウン ストリーム アプリケーションで使用することができます純粋な破骨細胞文化の大量に生産で信頼性の高いです。このプロトコルでは破骨細胞形成を誘導する RANKL または TNF α の使用を区別する破骨細胞形成 (RANKL) の生理学的なプロセスとして破骨細胞形成から病理学的プロセス (TNF α)、順番をガイドする 2 つの代替手段を提供します。決定は 1 つが下流のアプリケーションで使用する試薬の面で優れています。このプロトコルはまた、我々 が適切な骨吸収と骨疾患に関連するその後の研究の安全に使用することができます反 c fms 抗体濃度を判断できますメソッドを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では RANKL による破骨細胞形成、TNF α による破骨細胞形成と M CSF による破骨細胞前駆体の増殖に及ぼす抗 c-fms 抗体を調べた。破骨細胞形成 RANKL による破骨細胞形成・ TNF α による破骨細胞形成・ M CSF による破骨細胞前駆細胞の増殖を阻害する抗 c fms 抗体の有効量は異なることがわかった。
RANKL は、M-CSF の in vitro での存在下での破骨細胞形成を仲介してランク nul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、日本学術振興会科研費の一部によって支えられた (第 16 K 11776 H. k.、第 17 K ・ k ・ s、第 16 K ・ k ・ K、第 16 K m ・ s、第 18 K I. m 09862 20636 に 20637 17306。) 学術振興会から付与。
Materials
| Anti-c-Fms antibody | AFS98, a rat monoclonal, antimurine, c-Fms antibody (IgG2a) | ||
| TNF-α | Recombinant murine TNF-α prepared in our laboratory. TNF-α cDNA fragment cloned by RT-PCR and cloned into a pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) to generate a GST-fusion protein. GST-TNF-α was expressed in Escherichia coli BL21 cells cells (Stratagene, La Jolla, CA). The cells were lysed under nondenaturing conditions and GST-TNF-α was purified over a glutathione-Sepharose column. GST was cleaved off by PreScission Protease (Amersham Biosciences) by manufacturer’s directions and was removed by a glutathione-Sepharose column. | ||
| RANKL | PEPROTECH | 315-11 | Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E.coli |
| M-CSF | Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14–12 cell line culture supernatant at 5X106 cells in a 10-cm suspension culture dish. | ||
| α-MEM | Wako | with L-Glutamine and phenol red | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | s1820-500 | Fetal Bovine Serum French Origin |
| Culture dish | Corning | 100 mm x 20 mm style dish | |
| 96-well plate | Thermofischer Scientific | Nun clon Delta surface | |
| Cell counting kit-8 | Dojindo, Kumamoto, Japan | ||
| Microplate reader | Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan | ||
| Cell strainer | Corning | 40 μm Nylon | |
| Centrifuge tube | Corning | 50 mL CentriStar cap | |
| Triton X-100 | Wako | Polyoxyethylene (10) Octyphenyl ether |
References
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