تأثير الأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة على تشكيل اوستيوكلاست وانتشار اوستيوكلاست السلائف في المختبر
Summary
ويشمل هذا البروتوكول تشريح العظام الطويلة موريني والعزلة نخاع العظام، توليد الضامة نخاع العظام وإنتاج الآكلة مستعمرة بلعم حفز المنشط مستقبلات ليجند العامل النووي كابا-ب (رانكل) وعامل (م-CSF) باستخدام أو ألفا عامل نخر الورم (تنف-α) واعتقالهم من قبل الأضداد المضادة-ج-fms، مستقبلات M-CSF.
Abstract
يعيد البناء العظام عملية معقدة، وأنها تنطوي على فترات للترسيب وارتشاف. ارتشاف العظام هو عملية بموجبها العظام هو موزعة حسب الآكلة في الاستجابة للمحفزات المختلفة. اوستيوكلاست السلائف تفرق في الآكلة مولتينوكلير ردا على مستعمرة بلعم حفز المنشط مستقبلات ليجند العامل النووي كابا-ب (رانكل) وعامل (م-CSF). تحت ظروف مرضية، الشخصية سيتوكين مختلفة وتنطوي على مزيج السيتوكينات الالتهابية. ألفا عامل نخر الورم (تنف-α) واحد من السيتوكينات الأكثر أهمية كما أنها وجدت بكميات كبيرة في المناطق المعنية مع عظام النهايات التحريضية. والغرض من هذا البروتوكول هو توفير أسلوب الذي يتم عزل مورين نخاع العظام لتوليد الآكلة عن طريق الاستقراء مع الخدمات القطرية م وأما رانكل أو تنف-α التي سوف تكون منعت في وقت لاحق بزيادة جرعة من الأضداد المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة، مستقبلات ل M-CSF. وتبرز هذه التجربة القيمة العلاجية للأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة في أمراض التهاب العظام ارتشاف.
Introduction
الآكلة خلايا متخصصة للغاية، وأنها تفرق من الخلايا الجذعية المكونة للدم من خلال دمج متعددة اوستيوكلاست السلائف. أنها ضرورية لإعادة عرض العظام صحية والمساهمة في ارتشاف العظم باثولوجي المرتبطة بأمراض عظمية الالتهابات مثل التهاب المفاصل وأمراض اللثة1.
الدالة أوستيوكلاستوجينيسيس واوستيوكلاست هي توسط عاملين أساسيين؛ مستعمرة بلعم حفز المنشط مستقبلات للعامل النووي كابا-ب يجند (رانكل) وعامل (م-CSF). M-CSF ورانكل هامان ل التمايز اوستيوكلاست2. وثمة عامل آخر هو ما ثبت للحث على تشكيل اوستيوكلاست من نخاع العظم الضامة في المختبر هو عامل نخر الورم ألفا (تنف-α)3،،من45. تنف-α تشكيل اوستيوكلاست وساطة قد ثبت أن تكون حاسمة بالنسبة لعظام النهايات في أمراض العظام المدمرة مثل التهاب المفاصل6وامراض اللثة7و8من هشاشة العظام بعد سن إلياس.
ج-fms مستقبلات غشاء للخدمات القطرية م ويتوسط العمل به. دور ج-fms توثيقاً جيدا في الأدب كما أنها بينت أن إدارة جسم مضاد ضد ج-fms (الأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة) تماما اعتقل أوستيوكلاستوجينيسيس في نموذج لالتهاب المفاصل كذلك في تنف-α التي يسببها تقرحات العظام بينما وكان أوستيوكلاستوجينيسيس بعيدة من المشترك ملتهبة قوية لا تزال9. الإدارة للأجسام المضادة-ج-fms تثبيط ارتشاف العظم وتشكيل اوستيوكلاست الناجمة عن lipopolysaccharide (LPS) في الماوس كالفاريا10 كذلك كما هو الحال في التهاب اللثة الناجم عن لبس نموذج11. وعلاوة على ذلك، أعاقت الأجسام المضادة-ج-fms ارتشاف الجذر الميكانيكية الناجمة عن الإجهاد أثناء حركة الأسنان تقويم الأسنان12، فضلا عن حركة الأسنان تقويم الأسنان وارتشاف العظام المرتبطة بتقويم الأسنان حركة13.
M-CSF أبلغ إلى الوظائف الأخرى التي تعتبر أساسية للاستجابة المناعية المضيف. نظراً لغياب م-CSF في الفئران op/op مع الالتهاب الرئوي البكتيري يؤدي إلى زيادة عبء البكتيرية ونشر البكتيريا للكبد مع نخر كبدي14. ولذلك، المهم M-CSF للاستجابة المناعية في الحماية من العدوى.
وتوضح هذه الدراسة بفعل تأثير الأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة على م-CSF ورانكل أو تنف-α تشكيل اوستيوكلاست في المختبر والخدمات القطرية م التي يسببها انتشار السلائف اوستيوكلاست. هذا البروتوكول يوضح عزل خلايا نخاع العظام مورين من العظام الطويلة، والخطوات لتوليد الضامة نخاع العظام (بم) التي تعتبر كسلائف اوستيوكلاست والحث على التفريق بين بم في الآكلة مولتينوكلير اثنين الأساليب؛ أما رانكل أو تنف-α. ويقارن البروتوكول أيضا إلقاء القبض على أوستيوكلاستوجينيسيس في كلتا الطريقتين باستخدام الأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة.
العملية التي انتزعت نخاع العظام واستخدامها لاحقاً لتوليد السلائف اوستيوكلاست يعول عليها في إنتاج كميات كبيرة من الثقافات اوستيوكلاست الصرفة التي يمكن استخدامها في العديد من التطبيقات المصب مثل اختبار المخدرات. استخدام رانكل أو تنف-α للحث على أوستيوكلاستوجينيسيس في هذا البروتوكول يميز أوستيوكلاستوجينيسيس كعملية الفسيولوجية (رانكل) من أوستيوكلاستوجينيسيس كعملية باثولوجي (تنف-α)، التي توفر بدورها اثنين من الإجراءات البديلة لتوجيه قرار منها واحد متفوقة من حيث المواد الكاشفة لاستخدامها في تطبيقات المتلقين للمعلومات. ويوفر هذا البروتوكول أيضا أسلوب الذي يمكن أن نحدد تركيز مناسب للأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة التي يمكن استخدامها بأمان للدراسات المعنية بارتشاف العظام وأمراض عظمية في وقت لاحق.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة، ونحن التحقيق في تأثير الأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة على تشكيل المستحثة رانكل اوستيوكلاست، اوستيوكلاست تنف α-المستحثة بتشكيل وانتشار السلائف اوستيوكلاست CSF المستحثة م. وجدنا أن المبلغ الفعلي للأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة لتثبيط أوستيوكلاستوجينيسيس…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان تدعمها جزئيا كاكينهي JSPS منحة من “الجمعية اليابانية” “تعزيز العلوم” (رقم 16 ك 11776 إلى حاء ك، ك 17 رقم 17306 إلى ك. س.، رقم 16 ك 20637 إلى ك. ك.، رقم 16 ك 20636 إلى م. س.، رقم 18 ك 09862 م أولاً.).
Materials
| Anti-c-Fms antibody | AFS98, a rat monoclonal, antimurine, c-Fms antibody (IgG2a) | ||
| TNF-α | Recombinant murine TNF-α prepared in our laboratory. TNF-α cDNA fragment cloned by RT-PCR and cloned into a pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) to generate a GST-fusion protein. GST-TNF-α was expressed in Escherichia coli BL21 cells cells (Stratagene, La Jolla, CA). The cells were lysed under nondenaturing conditions and GST-TNF-α was purified over a glutathione-Sepharose column. GST was cleaved off by PreScission Protease (Amersham Biosciences) by manufacturer’s directions and was removed by a glutathione-Sepharose column. | ||
| RANKL | PEPROTECH | 315-11 | Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E.coli |
| M-CSF | Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14–12 cell line culture supernatant at 5X106 cells in a 10-cm suspension culture dish. | ||
| α-MEM | Wako | with L-Glutamine and phenol red | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | s1820-500 | Fetal Bovine Serum French Origin |
| Culture dish | Corning | 100 mm x 20 mm style dish | |
| 96-well plate | Thermofischer Scientific | Nun clon Delta surface | |
| Cell counting kit-8 | Dojindo, Kumamoto, Japan | ||
| Microplate reader | Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan | ||
| Cell strainer | Corning | 40 μm Nylon | |
| Centrifuge tube | Corning | 50 mL CentriStar cap | |
| Triton X-100 | Wako | Polyoxyethylene (10) Octyphenyl ether |
References
- Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss. Journal of Immunology Research. 2015, 281287 (2015).
- Teitelbaum, S. L. Bone resorption by osteoclasts. Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).
- Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts. Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4858-4864 (2000).
- Kobayashi, K., et al. Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction. Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 275-286 (2000).
- Kim, N., et al. Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis. Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 589-595 (2005).
- Redlich, K., et al. Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction. Journal of Clinical Investestigation. 110 (10), 1419-1427 (2002).
- Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor. Journal of Clinical Investestigation. 100 (6), 1557-1565 (1997).
- Zha, L., et al. TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).
- Kitaura, H., et al. M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3418-3427 (2005).
- Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64 (2), 219-227 (2012).
- Kimura, K., et al. An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model. Oral Diseases. 20 (3), 319-324 (2014).
- Kitaura, H., et al. An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice. Angle Orthodontist. 79 (5), 835-841 (2009).
- Kitaura, H., et al. An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement. Journal of Dental Research. 87 (4), 396-400 (2008).
- Bettina, A., et al. M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes. Journal of Immunology. 196 (12), 5047-5055 (2016).
- Dougall, W. C., et al. RANK is essential for osteoclast and lymph node development. Genes & Develpoment. 13 (18), 2412-2424 (1999).
- Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (12), 4828-4832 (1990).
- Yang, P. T., et al. Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 65 (12), 1671-1672 (2006).
- Takei, I., et al. High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints. The Journal of Rheumatology. 27 (4), 894-899 (2000).
