ההשפעה של נוגדן Anti-c-fms על היווצרות אוסטאוקלסט והתפשטות של קודמן אוסטאוקלסט במבחנה
Summary
פרוטוקול זה כולל ניתוח של עצמות ארוכות מאתר ובידוד מח עצם, ליצור מקרופאגים מח העצם ולייצר osteoclasts באמצעות המושבה מקרופאג מגרה פקטור (M-CSF), מפעיל קולטן של גרעיני גורם Kappa-B ליגנד (רנקל) או הגידול נקרוזה מקדם אלפא (TNF-α) ועל המעצר על ידי נוגדנים anti-c-fms, קולטן M-CSF.
Abstract
עצם שיפוץ הוא תהליך מורכב, זה כולל תקופות של התצהיר, ספיגת. ספיגת עצם הוא תהליך שבו עצם מתפרק על ידי osteoclasts בתגובה לגירויים שונים. אוסטאוקלסט מבשרי להתמיין osteoclasts multinuclear בתגובה המושבה מקרופאג מגרה פקטור (M-CSF), מפעיל קולטן של גרעיני גורם Kappa-B ליגנד (רנקל). בתנאים פיפטות, לפרופיל ציטוקינים שונים, כולל תערובת של ציטוקינים דלקתיים. הגידול נקרוזה מקדם אלפא (TNF-α) הוא אחד ציטוקינים החשוב ביותר כאשר הוא נמצא בכמויות גדולות באזורים מעורבים עם osteolysis דלקתיות. המטרה של פרוטוקול זה היא כדי לספק שיטה שבאמצעותה מח עצם מאתר מבודד כדי להפיק osteoclasts דרך אינדוקציה עם M-CSF רנקל או TNF-α אשר להיות מעוכבים לאחר מכן על ידי הגדלת מינון של נוגדן anti-c-fms, הקולטן עבור M-CSF. ניסוי זה מדגיש את הערך הטיפולי של נוגדן anti-c-fms במחלות של ספיגת עצם דלקתיות.
Introduction
Osteoclasts הם תאים מאוד מיוחדים, הם להבדיל מתאי גזע hematopoietic באמצעות היתוך גרעיני של מבשרי אוסטאוקלסט מרובים. הם חיוניים עבור עצם בריאה שיפוץ ולתרום ספיגת עצם פיפטות הקשורים במחלות דלקתיות osteolytic כגון דלקת מפרקים שגרונית, מחלת חניכיים1.
Osteoclastogenesis ואוסטאוקלסט הם מתווכת על-ידי שני גורמים מרכזיים; מקרופאג המושבה מגרה פקטור (M-CSF), מפעיל קולטן של גרעיני גורם kappa-B ליגנד (רנקל). M-CSF והן רנקל חשובים עבור אוסטאוקלסט בידול2. גורם נוסף אשר הוכח לגרום אוסטאוקלסט היווצרות של מח העצם מקרופאגים במבחנה הוא הגידול נקרוזה מקדם אלפא (TNF-α)3,4,5. TNF-α אוסטאוקלסט בתיווך היווצרות הוכח להיות קריטי עבור osteolysis עצם הרסני מחלות כגון דלקת מפרקים שגרונית6, מחלת חניכיים7באוסטיאופורוזיס בגיל המעבר8.
C-fms הקולטן ממברנה של M-CSF, ומתווך הפעולה שלה. התפקיד של c-fms מתועד היטב בספרות כפי הוכח כי הממשל של נוגדן נגד c-fms (נוגדן anti-c-fms) לחלוטין נעצר osteoclastogenesis במודל דלקת מפרקים, כמו גם ב- TNF-α המושרה ארוזיות העצם בזמן osteoclastogenesis מרוחק מן המפרק מודלק היה עדיין חזקים9. ניהול של נוגדן anti-c-fms עכבות היווצרות אוסטאוקלסט ספיגת עצם המושרה על ידי ליפופוליסכריד (LPS) העכבר calvariae10 באותה מידה כמו חניכיים LPS-induced דגם11. יתר על כן, נוגדן anti-c-fms עכבות ספיגת השורש מפגינות מכני במהלך התנועה השן אורתודונטי12, כמו גם תנועת השן אורתודונטי, ספיגת עצם המזוהים עם תנועת השן אורתודונטי13.
M-CSF דווח שיש פונקציות אחרות החיוניות על התגובה החיסונית של המארח. העדר של M-CSF בעכברים op/המבצע עם דלקת ריאות חיידקית להוביל והגדלת הנטל חיידקי והפצה בקטריאלי בכבד עם נמק בכבד14. לכן, M-CSF הוא חשוב עבור תגובה חיסונית בהגנה מפני הידבקות.
מחקר זה מדגים ההשפעה של נוגדן anti-c-fms על M-CSF ו רנקל או TNF-α המושרה אוסטאוקלסט היווצרות במבחנה ו M-CSF המושרה התפשטות אוסטאוקלסט סימנים מקדימים. פרוטוקול זה מדגים את ניתוקה של תאים במח העצם מאתר עצמות ארוכות, ואת השלבים ליצירת מח עצם מקרופאגים (BMM) אשר נחשבים אוסטאוקלסט מבשרי, כדי לעודד את הבידול של BMM לתוך multinuclear osteoclasts על ידי שניים שיטות; רנקל או TNF-α. הפרוטוקול משווה גם מעצרו של osteoclastogenesis של שתי השיטות באמצעות נוגדן anti-c-fms.
התהליך שבאמצעותו הוא במח העצם חילוצם ואופן השימוש בהם לאחר מכן ליצור סימנים מקדימים אוסטאוקלסט הוא אמין לייצר כמויות גדולות של תרבויות אוסטאוקלסט טהור, אשר ניתן להשתמש ביישומים במורד הזרם מרובות כגון בדיקות סמים. השימוש רנקל או TNF-α כדי לגרום osteoclastogenesis של פרוטוקול זה מבדיל osteoclastogenesis כתהליך הפיזיולוגיות (רנקל) מ- osteoclastogenesis כתהליך פיפטות (TNF-α), אשר בתורו מספק שני הליכים חלופיים כדי להנחות ההחלטה אשר אחד עדיפה מבחינת ריאגנטים ביישומים במורד הזרם. פרוטוקול זה מספק גם שיטה שבאמצעותה אנו יכולים לקבוע ריכוז מתאים של נוגדן anti-c-fms שיכול לשמש בבטחה ללימודים מאוחר יותר מעורב ספיגת עצם ומחלות osteolytic.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה, חקרנו את ההשפעה של נוגדן anti-c-fms על היווצרות אוסטאוקלסט רנקל-induced, TNF-α-induced אוסטאוקלסט היווצרות והתפשטות קודמן אוסטאוקלסט M-CSF-induced. מצאנו כי כמות נוגדנים anti-c-fms עבור עיכוב של osteoclastogenesis בין היווצרות אוסטאוקלסט רנקל-induced, TNF-α המושרה אוסטאוקלסט היווצרות ו- M-CSF-induced התפשטות אוסטאוקלסט מב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמך בחלקה על ידי KAKENHI JSPS מענק של האגודה יפן קידום של מדע (מס 16K 11776 ל ה ק, מס 17K 17306 ל ק. ס., מס 16 קיי 20637 ל ק ק, מס 16 קיי 20636 כדי טרום וסת, מס 18 קאראט 09862 ל מ ט.).
Materials
| Anti-c-Fms antibody | AFS98, a rat monoclonal, antimurine, c-Fms antibody (IgG2a) | ||
| TNF-α | Recombinant murine TNF-α prepared in our laboratory. TNF-α cDNA fragment cloned by RT-PCR and cloned into a pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) to generate a GST-fusion protein. GST-TNF-α was expressed in Escherichia coli BL21 cells cells (Stratagene, La Jolla, CA). The cells were lysed under nondenaturing conditions and GST-TNF-α was purified over a glutathione-Sepharose column. GST was cleaved off by PreScission Protease (Amersham Biosciences) by manufacturer’s directions and was removed by a glutathione-Sepharose column. | ||
| RANKL | PEPROTECH | 315-11 | Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E.coli |
| M-CSF | Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14–12 cell line culture supernatant at 5X106 cells in a 10-cm suspension culture dish. | ||
| α-MEM | Wako | with L-Glutamine and phenol red | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | s1820-500 | Fetal Bovine Serum French Origin |
| Culture dish | Corning | 100 mm x 20 mm style dish | |
| 96-well plate | Thermofischer Scientific | Nun clon Delta surface | |
| Cell counting kit-8 | Dojindo, Kumamoto, Japan | ||
| Microplate reader | Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan | ||
| Cell strainer | Corning | 40 μm Nylon | |
| Centrifuge tube | Corning | 50 mL CentriStar cap | |
| Triton X-100 | Wako | Polyoxyethylene (10) Octyphenyl ether |
References
- Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss. Journal of Immunology Research. 2015, 281287 (2015).
- Teitelbaum, S. L. Bone resorption by osteoclasts. Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).
- Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts. Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4858-4864 (2000).
- Kobayashi, K., et al. Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction. Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 275-286 (2000).
- Kim, N., et al. Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis. Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 589-595 (2005).
- Redlich, K., et al. Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction. Journal of Clinical Investestigation. 110 (10), 1419-1427 (2002).
- Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor. Journal of Clinical Investestigation. 100 (6), 1557-1565 (1997).
- Zha, L., et al. TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).
- Kitaura, H., et al. M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3418-3427 (2005).
- Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64 (2), 219-227 (2012).
- Kimura, K., et al. An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model. Oral Diseases. 20 (3), 319-324 (2014).
- Kitaura, H., et al. An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice. Angle Orthodontist. 79 (5), 835-841 (2009).
- Kitaura, H., et al. An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement. Journal of Dental Research. 87 (4), 396-400 (2008).
- Bettina, A., et al. M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes. Journal of Immunology. 196 (12), 5047-5055 (2016).
- Dougall, W. C., et al. RANK is essential for osteoclast and lymph node development. Genes & Develpoment. 13 (18), 2412-2424 (1999).
- Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (12), 4828-4832 (1990).
- Yang, P. T., et al. Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 65 (12), 1671-1672 (2006).
- Takei, I., et al. High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints. The Journal of Rheumatology. 27 (4), 894-899 (2000).
