JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

الإشريكيّة القولونية-"على أساس تخليق البروتين" الخلية الحرة: البروتوكولات لتكنولوجيا منصة قوية ومرنة، وموجودا

Published: February 25, 2019
doi:
10.3791/58882
, , , ,
1Department of Biological Sciences,California Polytechnic State University, San Luis Obispo, 2Center for Applications in Biotechnology,California Polytechnic State University, San Luis Obispo, 3Department of Chemistry and Biochemistry,California Polytechnic State University, 4Department of Chemical and Biological Engineering,Northwestern University, 5Chemistry of Life Processes Institute,Northwestern University, 6Center for Synthetic Biology,Northwestern University, 7Interdisciplinary Biological Sciences Program,Northwestern University

Summary

هذا البروتوكول بالتفصيل الخطوات، والتكاليف، والمعدات اللازمة لتوليد كولاي-على أساس مقتطفات الخلية وتنفذ في المختبر البروتين التوليف التفاعلات في غضون 4 أيام أو أقل. للاستفادة من الطابع المرن لهذا النظام الأساسي للتطبيقات الواسعة، ونحن نناقش رد فعل الظروف التي يمكن تكييفها والأمثل.

Abstract

على مدى السنوات الخمسين الماضية، برز توليف بروتين الخلية الحرة (الحراجية) كتقنية قوية لتسخير قدرات الخلايا داخل أنبوب اختبار النسخي ومتعدية الجنسيات. تنتفي الحاجة إلى الحفاظ على بقاء الخلية، وإزالة الجدار الخلوي، الحراجية كانت التأسيسية للتطبيقات المستجدة في التحويلية بروتينات الصعبة تقليديا، فضلا عن التطبيقات في النماذج الأولية السريعة الهندسة الأيضية، وعلم الجينوم الوظيفي. لدينا الوسائل لتنفيذ كولاي-أساس الحراجية منصة تسمح للمستخدمين الجدد الوصول إلى العديد من هذه التطبيقات. هنا، نحن تصف أساليب إعداد مقتطف من خلال استخدام وسائل الإعلام المخصب وقوارير حيرة واستنساخه بطريقة تحلل الخلية على أساس sonication الانضباطي. يمكن ثم استخدام هذا المقتطف للتعبير البروتين قادرة على إنتاج 900 ميكروغرام/مل أو أكثر من مجلد سوبر أخضر نيون البروتين (سفجفب) في ح 5 فقط من الإعداد التجريبية لتحليل البيانات، ونظرا لأن مخزون الكاشف المناسب قد أعدت مسبقاً. بدء التشغيل المقدرة تكلفة الحصول على الكواشف هو $4,500 الذي سيتم الحفاظ على الآلاف من ردود أفعال بتكلفة تقدر دولار 0.021 الواحدة ميكروغرام بروتين التي تنتجها أو $0.019 كل ميليلتر من رد الفعل. بالإضافة إلى ذلك، تعكس أساليب التعبير البروتين سهولة الإعداد رد فعل ينظر في النظم المتاحة تجارياً بسبب الاستغلال الأمثل يمزج قبل الكاشف، في جزء صغير من التكلفة. لتمكين المستخدم من الاستفادة من الطابع المرن لمنهاج تطبيقات واسعة الحراجية، حددنا مجموعة متنوعة من جوانب المنهاج التي يمكن ضبطها والأمثل اعتماداً على الموارد المتاحة ونتائج تعبير البروتين المرجوة.

Introduction

وبرز توليف بروتين الخلية الحرة (الحراجية) تكنولوجيا التي قد مقفلة عددا من الفرص الجديدة لإنتاج البروتين والجينوم الوظيفي والهندسة الأيضية وأكثر في غضون 50 عاماً الماضية1،2. بالمقارنة مع القياسية في فيفو منابر التعبير البروتين، الحراجية توفر ثلاث مزايا رئيسية: 1) طبيعة الخلية خالية من المنصة تتيح إنتاج البروتينات التي يحتمل أن تكون السمية أو الخارجية ل الخلية3،4 ،،من56؛ 2) المنظمة للحمض النووي والأخذ بقالب الحمض النووي ترميز gene(s) لمصلحة قناة كل الطاقة الشاملة في رد فعل لإنتاج protein(s) الفائدة؛ و 3) الطبيعة المفتوحة للمنصة تمكن المستخدم من تعديل ورصد رد فعل الظروف والتكوين في الوقت الحقيقي7،8. يدعم هذا الوصول المباشر إلى رد فعل زيادة النظم البيولوجية مع كيمياء الموسعة وظروف الأكسدة والاختزال لإنتاج البروتينات رواية وضبط العمليات الأيضية2،9، 10-توجيه الوصول كما يسمح للمستخدم بالجمع بين فعل الحراجية مع فحوصات النشاط في نظام واحد-وعاء لزيادة سرعة التصميم-البناء-اختبار دورات11. القدرة على القيام برد فعل الحراجية في قطيرات صغيرة الحجم أو على الأجهزة المستندة إلى الورق كذلك يدعم جهود الاكتشاف الفائق والنماذج الأولية السريعة12،،من1314،15 ،16. ونتيجة لهذه المزايا وطبيعة النظام التوصيل والتشغيل، مكن الحراجية فريد مجموعة متنوعة من تطبيقات التكنولوجيا الحيوية مثل إنتاج البروتينات التي يصعب على التعبير عن سلوبلي في فيفو17، 19،،من 1820، والكشف عن المرض21،،من2223، على الطلب التحويلية18،24 ،25،،من2627، والتعليم28،29، كل منها التحلي بالمرونة وفائدة من منصة خالية من الخلية.

يمكن إنشاء النظم الحراجية من مجموعة متنوعة من ليساتيس الخام من كلا خطوط الخلية بدائية النواة وحقيقية النواة. يسمح هذا للحصول على خيارات متنوعة في النظام للاختيار، وكل منها لديها مزايا وعيوب اعتماداً على التطبيق للفائدة. كما تتفاوت النظم الحراجية في إعداد الوقت والتكلفة والإنتاجية. الأكثر شيوعاً المستخدمة خلية تنتج مقتطفات من جرثومة القمح وارنب خلية شبكية وخلايا الحشرات وخلايا الإشريكيّة القولونية ، مع كونه الأخير الأكثر فعالية من حيث التكلفة حتى الآن بينما تنتج غلات الحجمي أعلى من البروتين30 . بينما النظم الحراجية الأخرى يمكن أن يكون مفيداً لجهازهم التعديل بوستترانسلاشونال الفطرية، التطبيقات استخدام كولايالناشئة-استناداً إلى الآلية قادرة على سد الفجوة عن طريق توليد سيتيسبيسيفيكالي فوسفوريلاتيد و الغليكوزيلاتي البروتينات على الطلب31،،من3233،،من3435.

يمكن تشغيل الحراجية ردود الفعل أما دفعة واحدة، التبادل المستمر خلية خالية (سيكف) أو تنسيقات (CFCF) الخلية الحرة تدفق مستمر. تنسيق دفعة هو نظام مغلق عمر رد الفعل الذي محدود بسبب تناقص كميات كواشف مختبر وتراكم تركات المثبطة لرد الفعل. أساليب سيكف و CFCF زيادة العمر من رد فعل، ومما يسفر عن البروتين الحجمي زيادة غلة مقارنة برد فعل المجموعة. يتم ذلك عن طريق السماح للمنتجات الثانوية تخليق البروتين المراد إزالتها من وعاء التفاعل في حين يتم توفيره كواشف مختبر جديد طوال فترة رد الفعل2. في حالة CFCF، يمكن أيضا إزالة بروتين الفائدة من دائرة رد الفعل، بينما في سيكف، البروتينات تظل الفائدة في دائرة رد الفعل تتألف من36،شبه نفاذية الأغشية37. هذه الأساليب ذات قيمة خاصة في التغلب على ضعف غلة الحجمي البروتينات للتعبير عن اهتمام38،39،،من4041،42، 43. التحديات التي يواجهها تنفيذ النهج سيكف و CFCF هي 1) في حين أنها تسفر عن استخدام أكثر كفاءة للآلية البيولوجية المسؤولة عن النسخ والترجمة، أنها تتطلب كميات أكبر لا سيما من الكواشف التي تزيد من التكلفة الإجمالية و 2) وهي تتطلب أكثر تعقيداً رد فعل الأجهزة والمعدات المتخصصة مقارنة ب تنسيق دفعة44. من أجل ضمان إمكانية الوصول للمستخدمين الجدد، توضحها البروتوكولات التركيز على شكل دفعة في مجلدات رد فعل من 15 ميليلتر مع توصيات محددة من أجل زيادة حجم رد فعل لمقياس المليلتر.

الأساليب المقدمة هنا تمكين غير الخبراء ذوي المهارات المختبرية الأساسية (مثل طلاب المرحلة الجامعية) تنفيذ نمو الخلايا واستخراج إعداد الدفعة تنسيق إعداد رد فعل كولاي-استناداً إلى نظام الحراجية. وهذا النهج فعالة من حيث التكلفة مقارنة بمجموعات المتاحة تجارياً دون التضحية بالسهولة لإعداد رد فعل يستند إلى مجموعة. وعلاوة على ذلك، يمكن هذا النهج التطبيقات في المختبر وفي الميدان. المستخدمين الجدد تماما عند اتخاذ قرار لتنفيذ الحراجية، ينبغي تقييم فعالية أنظمة تعبير البروتين التقليدية للاستثمار بدء التشغيل، الحراجية قد لا تكون متفوقة في كل حالة. الطرق الحراجية الموضحة هنا تمكين المستخدم لمباشرة تنفيذ مجموعة متنوعة من التطبيقات، بما في ذلك الجينوم الوظيفي، الاختبار، وإنتاج البروتينات التي مستعصية على الحل للتعبير في فيفو ، فضلا عن الحقل الفائق التطبيقات بما في ذلك أجهزة استشعار العوامل البيولوجية ومواد تعليمية للبيولوجيا التركيبية. تطبيقات إضافية مثل الهندسة الأيضية وضبط شروط التعبير البروتين والكشف عن المرض، والارتقاء باستخدام أساليب سيكف أو CFCF لا تزال ممكنة ولكن قد تتطلب خبرة مع منصة الحراجية لمزيد من التعديل من رد فعل شروط. لدينا طرق الجمع بين النمو في وسائل الإعلام المخصب وقوارير حيرة، مع طرق سريعة نسبيا واستنساخه من تحلل الخلية عن طريق سونيكيشن، متبوعاً بإعداد رد فعل الحراجية مبسطة التي تستخدم قبل المزيج الأمثل45. بينما قد تصبح أساليب النمو الخلوي موحدة إلى حد ما داخل هذا الحقل، طرق لتحلل الخلية تختلف على نطاق واسع. بالإضافة إلى سونيكيشن، وتشمل المشتركة تحلل أساليب الاستفادة من صحافة فرنسية والخالطون، وحبه المضارب، أو lysozyme وأخرى تعطل البيوكيميائية والفيزيائية أساليب46،47،48، 49-استخدام أساليب عملنا، ويتم الحصول على حوالي 2 مل استخراج النفط الخام الخلية الواحدة 1 لتر خلايا. ويمكن دعم هذه الكمية من استخراج خلية أربعمائة 15 ميليلتر الحراجية من ردود الفعل، وكل إنتاج ~ 900 ميكروغرام/مل من البروتين سفجفب مراسل من قالب بلازميد pJL1-سفجفب. هذا الأسلوب يكلف $0.021/ميكروغرام سفجفب المنتجة ($.019/ميليلتر من رد الفعل)، باستثناء تكلفة العمالة والمعدات (تكميلية الشكل 1). ابتداء من الصفر، هذا الأسلوب يمكن تنفيذها في 4 أيام في شخص واحد، وكرر الحراجية ردود فعل يمكن أن تنجز في غضون ساعات (الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك، يمكن الارتقاء بالبروتوكول في تخزين لدفعات أكبر من إعداد كاشف لتناسب احتياجات المستخدم. الأهم من ذلك، يمكن تنفيذ البروتوكول المعروضة هنا غير مختبر تدريب الخبراء مثل طلاب المرحلة الجامعية، كما أنه يتطلب فقط المهارات المختبرية الأساسية. قد وضعت خصيصا لتحسين إمكانية الحصول على منصة الحراجية كولاي للاستخدام الواسع الإجراءات الواردة أدناه، والفيديو المصاحبة.

Protocol

1-وسائل الإعلام إعداد ونمو الخلايا 1 يوم خلايا BL21*(DE3) كولاي متواصلة من والغليسيرول الأسهم على صفيحة أجار رطل واحتضانها لمالا يقل عن 18 ح عند 37 درجة مئوية. إعداد 50 مل الإعلام رطل والاوتوكلاف الحل على أساس دورة سائل لمدة 30 دقيقة في 121 درجة مئوية. تخزين في درجة حرار?…

Representative Results

وقد قدمنا على أساس سونيكيشن كولاي استخراج إعداد البروتوكول التي يمكن إنجازها على مدى أربعة أيام، مع الرقم 1 يدل انهيار الإجرائية أكثر من كل يوم. وهناك قابلية تطويع للخطوات التي يمكن أن تنجز في كل يوم مع مختلف نقاط التوقف، ولكن وجدنا سير العمل هذا لتكو…

Discussion

تخليق البروتين الخلية الحرة برز كتقنية قوية وملائمة لمجموعة متنوعة من التطبيقات تتراوح التحويلية سريع نموذجي الأنظمة البيوكيميائية. ويدعم القدرة على رصد ومعالجة وزيادة الأجهزة الخلوية في الوقت الحقيقي إلى اتساع نطاق التطبيقات. وعلى الرغم من تأثير هذه التكنولوجيا منصة الآخذة في التوسع،…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

المؤلف تود أن تقر الدكتورة جنيفر فانديركيلين، أندريا لوبسشير، وتوني تارتو للدعم التقني ويسلي كاو، لين وليامز وهايت كريستوفر لإجراء مناقشات مفيدة. المؤلف يعترفون أيضا بدعم تمويلي من بيل وليندا الصقيع الصندوق، مركز التطبيقات في شركة شيفرون التكنولوجيا الحيوية تطبيق البحوث الهبات المنح للتكنولوجيا الحيوية والبحوث بولي كال، علمية وبرنامج منح الأنشطة الإبداعية (رسكا 2017)، ومؤسسة العلوم الوطنية (NSF-1708919). [مزل] تسلم “المنحة خريج جامعة كاليفورنيا الدولة”. MCJ يعترف الجيش بحوث مكتب W911NF-16-1-0372، تمنح “المؤسسة الوطنية للعلوم” 1413563 المجلس والمجلس-1716766، والقوة الجوية البحوث مختبر مركز التميز منحة FA8650-15-2-5518، “منحة وكالة الحد من تهديد الدفاع” HDTRA1-15-10052/P00001، وديفيد ولوسيل باكارد، البرنامج المعلم-الباحث كاميل دريفوس، الإدارة للطاقة البر المنح دي-SC0018249، برنامج العلوم البشرية الحدود (RGP0015/2017)، منحة أتوب معهد الجينوم المشترك الفلاني، و شيكاغو الكونسورتيوم الطبية بدعم من “أموال سيرل” في “ثقة المجتمع شيكاغو” للدعم.

Materials

Luria Broth ThermoFisher 12795027
Tryptone Fisher Bioreagents 73049-73-7
Yeast Extract Fisher Bioreagents 1/2/8013
NaCl Sigma-Aldrich S3014-1KG
Potassium Phosphate Dibasic Sigma-Aldrich 60353-250G
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P9791-500G
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
KOH Sigma-Aldrich P5958-500G
IPTG Sigma-Aldrich I6758-1G
Mg(OAc)2 Sigma-Aldrich M5661-250G
K(OAc) Sigma-Aldrich P1190-1KG
Tris(OAc) Sigma-Aldrich T6066-500G
DTT ThermoFisher 15508013
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001
Folinic Acid Sigma-Aldrich F7878-100MG
NTPs ThermoFisher R0481
Oxalic Acid Sigma-Aldrich P0963-100G
NAD Sigma-Aldrich N8535-15VL
CoA Sigma-Aldrich C3144-25MG
PEP Sigma-Aldrich 860077-250MG
K(Glu) Sigma-Aldrich G1501-500G
NH4(Glu) MP Biomedicals 02180595.1
Mg(Glu)2 Sigma-Aldrich 49605-250G
Spermidine Sigma-Aldrich S0266-5G
Putrescine Sigma-Aldrich D13208-25G
HEPES ThermoFisher 11344041
Molecular Grade Water Sigma-Aldrich 7732-18-5
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A7219-100G
L-Valine Sigma-Aldrich V0500-25G
L-Tryptophan Sigma-Aldrich T0254-25G
L-Phenylalanine Sigma-Aldrich P2126-100G
L-Isoleucine Sigma-Aldrich I2752-25G
L-Leucine Sigma-Aldrich L8000-25G
L-Cysteine Sigma-Aldrich C7352-25G
L-Methionine Sigma-Aldrich M9625-25G
L-Alanine Sigma-Aldrich A7627-100G
L-Arginine Sigma-Aldrich A8094-25G
L-Asparagine Sigma-Aldrich A0884-25G
Glycine Sigma-Aldrich G7126-100G
L-Glutamine Sigma-Aldrich G3126-250G
L-Histadine Sigma-Aldrich H8000-25G
L-Lysine Sigma-Aldrich L5501-25G
L-Proline Sigma-Aldrich P0380-100G
L-Serine Sigma-Aldrich S4500-100G
L-Threonine Sigma-Aldrich T8625-25G
L-Tyrosine Sigma-Aldrich T3754-100G
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mL Fisher Scientific 05-408-138
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL Fisher Scientific 05-408-129
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mL Fisher Scientific 05-408-120
PureLink HiPure Plasmid Prep Kit ThermoFisher K210007
Ultrasonic Processor QSonica Q125-230V/50Hz 3.175 mm diameter probe
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
JLA-8.1000 Rotor Beckman Coulter 366754
1L Centrifuge Tube Beckman Coulter A99028
Tunair 2.5L Baffeled Shake Flask Sigma-Aldrich Z710822
Microfuge 20 Beckman Coulter B30134
New Brunswick Innova 42/42R Incubator Eppendorf M1335-0000
Cytation 5 BioTek
Strep-Tactin XT Starter Kit IBA 2-4998-000
pJL1-sfGFP Addgene 69496
BL21(DE3) New England BioLabs
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and Systems Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
  2. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
  3. Watanabe, M. Cell-Free Protein Synthesis for Structure Determination by X-ray Crystallography. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 607, 149-160 (2010).
  4. Martemyanov, K. A., Shirokov, V. A., Kurnasov, O. V., Gudkov, A. T., Spirin, A. S. Cell-Free Production of Biologically Active Polypeptides: Application to the Synthesis of Antibacterial Peptide Cecropin. Protein Expression and Purification. 21 (3), 456-461 (2001).
  5. Renesto, P., Raoult, D. From genes to proteins: in vitro expression of rickettsial proteins. Annals of the New York Academy of Sciences. 990, 642-652 (2003).
  6. Xu, Z., Chen, H., Yin, X., Xu, N., Cen, P. High-Level Expression of Soluble Human b-Defensin-2 Fused With Green Fluorescent Protein in Escherichia coli Cell-Free System. Applied Biochemistry and Biotechnology. 127 (1), 053-062 (2005).
  7. Baumann, A. In-situ observation of membrane protein folding during cell-free expression. PLoS ONE. 11 (3), 1-15 (2016).
  8. Wang, Y., Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnology. 9, 1-8 (2009).
  9. Whittaker, J. W. Cell-free protein synthesis: the state of the art. Biotechnology Letters. 35 (2), 143-152 (2013).
  10. Martin, R. W. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. 9 (1), 1203 (2018).
  11. Kwon, Y. C., Song, J. K., Kim, D. M. Cloning-Independent Expression and Screening of Enzymes Using Cell-Free Protein Synthesis Systems. Methods in Molecular Biology. 1118, 97-108 (2014).
  12. Chappell, J., Jensen, K., Freemont, P. S. Validation of an entirely in vitro approach for rapid prototyping of DNA regulatory elements for synthetic biology. Nucleic Acids Research. 41 (5), 3471-3481 (2013).
  13. Takahashi, M. K. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
  14. Karim, A. S., Jewett, M. C. A cell-free framework for rapid biosynthetic pathway prototyping and enzyme discovery. Metabolic Engineering. 36, 116-126 (2016).
  15. Dudley, Q. M., Anderson, K. C., Jewett, M. C. Cell-Free Mixing of Escherichia coli Crude Extracts to Prototype and Rationally Engineer High-Titer Mevalonate Synthesis. ACS Synthetic Biology. 5 (12), 1578-1588 (2016).
  16. Pardee, K. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  17. Zawada, J. F. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production-a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
  18. Sullivan, C. J. A cell-free expression and purification process for rapid production of protein biologics. Biotechnology Journal. 11 (2), 238-248 (2016).
  19. Li, J. Cell-free protein synthesis enables high yielding synthesis of an active multicopper oxidase. Biotechnology Journal. 11 (2), 212-218 (2016).
  20. Heinzelman, P., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. pH responsive granulocyte colony-stimulating factor variants with implications for treating Alzheimer’s disease and other central nervous system disorders. Protein Engineering Design and Selection. 28 (10), 481-489 (2015).
  21. Pardee, K. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  22. Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (47), 14429-14435 (2015).
  23. Gootenberg, J. S. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  24. Pardee, K. Portable, On-Demand Biomolecular Manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259 (2016).
  25. Karig, D. K., Bessling, S., Thielen, P., Zhang, S., Wolfe, J. Preservation of protein expression systems at elevated temperatures for portable therapeutic production. Journal of the Royal Society, Interface. 14 (129), (2017).
  26. Smith, M. T., Berkheimer, S. D., Werner, C. J., Bundy, B. C. Lyophilized Escherichia coli-based cell-free systems for robust, high-density, long-term storage. BioTechniques. 56 (4), 186-193 (2014).
  27. Hunt, J. P., Yang, S. O., Wilding, K. M., Bundy, B. C. The growing impact of lyophilized cell-free protein expression systems. Bioengineered. 8 (4), 325-330 (2017).
  28. Stark, J. C. BioBitsTM Bright: A fluorescent synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), (2018).
  29. Huang, A. BioBitsTM Explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), (2018).
  30. Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-Free Protein Synthesis: Pros and Cons of Prokaryotic and Eukaryotic Systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
  31. Oza, J. P. Robust production of recombinant phosphoproteins using cell-free protein synthesis. Nature Communications. 6 (1), 8168 (2015).
  32. Zemella, A. Cell-free protein synthesis as a novel tool for directed glycoengineering of active erythropoietin. Scientific Reports. 8 (1), 8514 (2018).
  33. Jaroentomeechai, T. Single-pot glycoprotein biosynthesis using a cell-free transcription-translation system enriched with glycosylation machinery. Nature Communications. 9 (1), 2686 (2018).
  34. Kightlinger, W. Design of glycosylation sites by rapid synthesis and analysis of glycosyltransferases. Nature Chemical Biology. 14 (6), 627-635 (2018).
  35. Schoborg, J. A. A cell-free platform for rapid synthesis and testing of active oligosaccharyltransferases. Biotechnology and Bioengineering. 115 (3), 739-750 (2018).
  36. Chekulayeva, M. N., Kurnasov, O. V., Shirokov, V. A., Spirin, A. S. Continuous-Exchange Cell-Free Protein-Synthesizing System: Synthesis of HIV-1 Antigen Nef. Biochemical and Biophysical Research Communications. 280 (3), 914-917 (2001).
  37. Hong, S. H. Improving Cell-Free Protein Synthesis through Genome Engineering of Escherichia coli Lacking Release Factor 1. ChemBioChem. 16 (5), 844-853 (2015).
  38. Endo, Y., Otsuzuki, S., Ito, K., Miura, K. Production of an enzymatic active protein using a continuous flow cell-free translation system. Journal of Biotechnology. 25 (3), 221-230 (1992).
  39. Volyanik, E. V., Dalley, A., Mckay, I. A., Leigh, I., Williams, N. S., Bustin, S. A. Synthesis of Preparative Amounts of Biologically Active Interleukin-6 Using a Continuous-Flow Cell-Free Translation System. Analytical Biochemistry. 214 (1), 289-294 (1993).
  40. Martin, G. A., Kawaguchi, R., Lam, Y., DeGiovanni, A., Fukushima, M., Mutter, W. High-yield, in vitro protein expression using a continuous-exchange, coupled transcription/ translation system. BioTechniques. 31 (4), 948-950 (2001).
  41. Stech, M., Quast, R. B., Sachse, R., Schulze, C., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. A Continuous-Exchange Cell-Free Protein Synthesis System Based on Extracts from Cultured Insect Cells. PLoS ONE. 9 (5), e96635 (2014).
  42. Quast, R. B., Sonnabend, A., Stech, M., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. High-yield cell-free synthesis of human EGFR by IRES-mediated protein translation in a continuous exchange cell-free reaction format. Scientific Reports. 6 (1), 30399 (2016).
  43. Thoring, L., Dondapati, S. K., Stech, M., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. High-yield production of "difficult-to-express" proteins in a continuous exchange cell-free system based on CHO cell lysates. Scientific Reports. 7 (1), 11710 (2017).
  44. Hoffmann, M., Nemetz, C., Madin, K., Buchberger, B. Rapid translation system: A novel cell-free way from gene to protein. Biotechnology annual review. 10, 1-30 (2004).
  45. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5 (1), 8663 (2015).
  46. Katsura, K. A reproducible and scalable procedure for preparing bacterial extracts for cell-free protein synthesis. Journal of Biochemistry. 162 (June), 357-369 (2017).
  47. Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 1-15 (2016).
  48. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  49. Krinsky, N. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS ONE. 11 (10), (2016).
  50. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
  51. Swartz, J. R., Jewett, M. C., Woodrow, K. A. Cell-Free Protein Synthesis With Prokaryotic Combined Transcription-Translation. Recombinant Gene Expression. (267), 169-182 (2004).
  52. Voloshin, A. M., Swartz, J. R. Efficient and scalable method for scaling up cell free protein synthesis in batch mode. Biotechnology and Bioengineering. 91 (4), 516-521 (2005).
  53. Vernon, W. B. The role of magnesium in nucleic-acid and protein metabolism. Magnesium. 7 (5-6), 234-248 (1988).
  54. Pratt, J. M. . Transcription and Translation: A Practical Approach. , (1984).
  55. Kim, D. M., Kigawa, T., Choi, C. Y., Yokoyama, S. A Highly Efficient Cell-Free Protein Synthesis System from Escherichia coli. European Journal of Biochemistry. 239 (3), 881-886 (1996).
  56. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4 (1), 8 (2010).
  57. Zubay, G. In Vitro Synthesis of Protein in Microbial Systems. Annual Review of Genetics. 7 (1), 267-287 (1973).
  58. Kigawa, T. Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression. Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1/2), 63-68 (2004).
  59. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia Coli S30 Extract Preparation for Economical Cell-Free Protein Synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2008).
  60. Yang, W. C., Patel, K. G., Wong, H. E., Swartz, J. R. Simplifying and streamlining Escherichia coli-based cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 28 (2), 413-420 (2012).
  61. Foshag, D. The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production. New Biotechnology. 40 (Pt B), 245-260 (2018).
  62. Caschera, F. Bacterial cell-free expression technology to in vitro systems engineering and optimization. Synthetic and Systems Biotechnology. 2 (2), 97-104 (2017).
  63. Chizzolini, F., Forlin, M., Yeh Martín, N., Berloffa, G., Cecchi, D., Mansy, S. S. Cell-Free Translation Is More Variable than Transcription. ACS Synthetic Biology. 6 (4), 638-647 (2017).
  64. Hong, S. H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis. Frontiers in Chemistry. 2, 34 (2014).
  65. Sawasaki, T., Ogasawara, T., Morishita, R., Endo, Y. A cell-free protein synthesis system for high-throughput proteomics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (23), 14652-14657 (2002).
  66. Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: Biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
  67. Garcia, D. C. Elucidating the potential of crude cell extracts for producing pyruvate from glucose. Synthetic Biology. 3 (1), 1-9 (2018).
  68. Hurst, G. B. Proteomics-Based Tools for Evaluation of Cell-Free Protein Synthesis. Analytical Chemistry. 89 (21), 11443-11451 (2017).

Tags

Escherichia ColiCell-free Protein SynthesisProtocolPlatform TechnologyFunctional GenomicsBiosensorsMetabolic EngineeringGenetic Code ExpansionCentrifugationS30 BufferDTTResuspensionAliquoting

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. J. Vis. Exp. (144), e58882, doi:10.3791/58882 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image