Escherichia coli-המבוסס על סינתזת החלבון ללא תא: פרוטוקולים עבור טכנולוגיית פלטפורמה חזקים, גמישים ונגישים

סינתזת חלבון נטול תאים (CFPS) התפתחה טכנולוגיה נעול מספר הזדמנויות חדשות עבור ייצור החלבון, גנומיקה תפקודית, הנדסה מטבולית ועוד בתוך^1,50 שנה שעברה². לעומת תקן ויוו פלטפורמות ביטוי חלבון, CFPS מספק שלושה יתרונות מרכזיים: 1) הטבע ללא תא של הפלטפורמה מאפשרת הייצור של חלבונים זה יהיה פוטנציאל רעיל או זרות תא^{3,4 5, ,6}; 2) איון של הדנ א, ההקדמה של תבנית ה-DNA קידוד של gene (s) עניין לנתב את כל האנרגיה מערכתית בתוך התגובה לייצור של protein(s) עניין; ו 3) מהות הפלטפורמה הפתוחה מאפשר למשתמש לשנות ולנטר את תנאי ריאקציה ו קומפוזיציה בזמן אמת^7,8. זו גישה ישירה אל התגובה תומך את הגדלת של מערכות ביולוגיות עם תנאים חמצון-חיזור לייצור חלבונים הרומן, כוונון של תהליכים מטבוליים^2,9, וא מורחב ¹⁰. ישיר גישה גם מאפשר למשתמש לשלב את התגובה CFPS עם פעילות מבחני במערכת יחיד-סיר עבור מהירה יותר-מבחן עיצוב לבנות מחזורי¹¹. היכולת לבצע את התגובה CFPS נפח קטן טיפות או במכשירים המבוססים על נייר נוספת תומך במאמצי הגילוי תפוקה גבוהה, שטנץ מהירה^{12,13,14,15 ,16}. בשל יתרונות אלה ואת אופי הכנס-הפעל של המערכת, CFPS באופן ייחודי איפשר מגוון רחב של יישומי ביוטכנולוגיה למשל, ייצור חלבונים שקשה לבטא solubly ויוו^{17, 18,19,20}, הגילוי של המחלה^21,22,23, על פי דרישה biomanufacturing^{18,24 ,25,26,27}, ו חינוך^28,29, אשר כולם להראות את הגמישות ואת השירות של פלטפורמת נטול תאים.

CFPS מערכות יכול להיווצר מתוך מגוון של lysates גסה של שני הקווים תא prokaryotic, האיקריוטים. דבר זה מאפשר אפשרויות מגוונות במערכת של בחירה, שלכל אחד מהם יש יתרונות וחסרונות בהתאם ליישום של עניין. CFPS מערכות גם שוני רב בין זמן הכנה, עלות, יעילות. הכי נפוץ מנוצל תא תמציות מופקות מן נבט חיטה, ארנב רטיקולוציט, חרקים תאים ותאים Escherichia coli , הלה. החסכוני ביותר לתאריך תוך כדי לייצר את התשואות הנפחי הגבוה ביותר של חלבון³⁰ . בעוד מערכות אחרות CFPS יכול להיות יתרון עבור מכונות מולדת השינוי post-translational שלהם, המתעוררים יישומים המשתמשים של e. coli-מכונות מבוסס מסוגלים לגשר על הפער על ידי יצירת site-specifically phosphorylated, חלבונים glycosylated על פי דרישה^{31,32,33,34,35}.

תגובות CFPS ניתן להפעיל גם אצווה, רציף-exchange תא-חינם (CECF) או תבניות (CFCF) ללא תאים זרימה רציפה. הפורמט אצווה הוא מערכת סגורה החיים התגובה שלו הוא מוגבל בשל שמפחית כמויות המגיבים ואת ההצטברות של תוצרי לוואי המעכבת של התגובה. CECF ושיטות CFCF להגדיל את אורך החיים של התגובה, ובכך לגרום התשואות חלבון נפח מוגבר לעומת התגובה אצווה. זו מושגת על-ידי מתן לוואי של סינתזת חלבונים להסיר מיכל התגובה בזמן המגיבים חדשים מסופקים לאורך כל הקורס של התגובה². במקרה של CFCF, החלבון של עניין ניתן גם להסיר מן החדר התגובה, תוך כדי CECF, החלבון שרידי עניין בבית הבליעה התגובה המורכב של^36,קרום חדיר למחצה³⁷. שיטות אלה יקרים במיוחד להתגבר על עניים התשואות הנפחי של חלבונים-קשה-אקספרס של עניין^{38,39,40,41,42, 43}. האתגרים ביישום הגישות CECF ו- CFCF הם 1) בעוד הם תוצאה של שימוש יעיל יותר של מכונות ביו אחראי תמלול ותרגום, הם דורשים כמויות גדולות יותר ובמיוחד של ריאגנטים המגבירה העלות הכוללת ו- 2) הם דורשים setups התגובה מורכבים יותר, ציוד מיוחד לעומת אצווה תבנית⁴⁴. על מנת להבטיח נגישות עבור משתמשים חדשים, הפרוטוקולים המפורטים להלן המיקוד על הפורמט אצווה בעוצמות התגובה של µL 15 עם המלצות ספציפיות להגברת שעוצמת התגובה הסולם מיליליטר.

השיטות שהוצגו במסמך זה לאפשר שאינם מומחים עם מיומנויות מעבדה בסיסיות (כגון סטודנטים לתואר ראשון) ליישם את צמיחת תאים, לחלץ הכנה של אצווה תבנית התגובה ההתקנה עבור e. coli-CFPS מערכת מבוססת. גישה זו היא חסכונית לעומת ערכות זמינים מסחרית מבלי להתפשר על הקלות של התגובה מבוסס ערכת ההתקנה. יתר על כן, גישה זו מאפשרת יישומים במעבדה ובשדה. כאשר אתה מחליט ליישם CFPS, משתמשים חדשים כדאי ביסודיות להעריך את היעילות של חלבון קונבנציונאלי מערכות ביטוי להשקעה הפעלה, כפי CFPS לא יכול להיות מעולה בכל מקרה. CFPS בשיטות המתוארות כאן לאפשר למשתמש ליישם באופן ישיר מגוון רחב של יישומים, כולל גנומיקה תפקודית, בדיקות, ייצור חלבונים שאינן פתירות ויוו הביטוי, כמו גם שדה תפוקה גבוהה יישומים כולל ביולוגיים וערכות חינוכיות עבור ביולוגיה סינתטית. יישומים נוספים כגון הנדסה מטבולית, כוונון של תנאי ביטוי חלבון, גילוי מחלות ושימוש הסולם בשיטות CECF או CFCF עדיין אפשריים אך עשויים לדרוש ניסיון עם פלטפורמת CFPS עבור שינוי נוסף של התגובה תנאים. השיטות שלנו לשלב הגידול, צלוחיות, בושם במבוכה ומדיה מועשר עם יחסית מהירה ושיטות לשחזור של פירוק התא דרך sonication, ואחריו מלכודת התגובה CFPS מפושטת אשר מנצל premixes ממוטבת⁴⁵. בעוד השיטות צמיחה סלולרי צריך להיות סטנדרטית במידה מסוימת בתוך שדה זה, שיטות פירוק תאים משתנים במידה רבה. בנוסף sonication, שיטות פירוק הנפוצות כוללות הניצול של מכבש צרפתי, עם מהמגן, חלמוני חרוז, או ליזוזים אחרים שיבוש ביוכימי ופיזית שיטות^{46,47,48, 49}. באמצעות השיטות שלנו, כ 2 מ ל תמצית תא גולמי מתקבלים לכל 1 ליטר של תאים. כמות זו של תמצית התא יכול לתמוך ארבע מאות תגובות CFPS µL 15, כל לעשיית ~ 900 µg/mL של הכתב sfGFP חלבון מן התבנית פלסמיד pJL1-sfGFP. בשיטה זו עלויות $0.021/µg של sfGFP מיוצר (.019$ / µL של תגובה), ללא העלות של עבודה וציוד (משלימה איור 1). מתחיל מאפס, בשיטה זו ניתן ליישם כבר 4 ימים על ידי אדם אחד וחזור CFPS תגובות יכולה להסתיים תוך שעות (איור 1). בנוסף, ניתן לשנות את הפרוטוקול באמצעי אחסון עבור אצוות גדול יותר של ריאגנט הכנה לצרכים של המשתמש. חשוב, ניתן ליישם את הפרוטוקול המובאת כאן על ידי מעבדה שהוכשרו הלא-מומחים כגון סטודנטים לתואר ראשון, כפי שהוא רק דורש מיומנויות מעבדה בסיסית. ההליכים המתוארים להלן ווידאו המלווה את פותחו במיוחד כדי לשפר את הנגישות של פלטפורמת CFPS e. coli לשימוש רחב.