大腸菌の無細胞タンパク質合成のベース: 堅牢な柔軟性とアクセス可能なプラットフォーム技術のためのプロトコル

無細胞タンパク質合成 (当たり) は、タンパク質の生産、機能ゲノム学、代謝工学と最後の 50 年間^1,2以内に詳細のための新しい機会の数をアンロックしている技術として浮上しています。株当たり標準生体内タンパク質式プラットフォームと比較して、3 つの利点を提供します: 1) 携帯無料自然のプラットフォームの潜在的毒性や細胞の^{3,4 外国語になるタンパク質の製造を可能に ,5,6};2) ゲノム DNA の不活性化および興味の遺伝子を符号化する DNA テンプレートの導入が関心のタンパク質の生産への反応の中で全身のエネルギーのすべてをチャネルします。・ 3) プラットフォームのオープンな性質により、ユーザーが変更したり、反応条件とリアルタイム^7,8の組成を監視します。この反応への直接アクセスをサポートしている拡張化学や新規タンパク質の生産と代謝過程^2,9,のチューニングのための酸化還元状態の生物学的システムの増強¹⁰. 直接のアクセスは、ユーザーがより迅速な設計、ビルド、テスト サイクル¹¹のシングル ポット システムで活性測定法と当たりの反応を組み合わせることもできます。紙ベースのデバイスのさらなるサポート ハイスループット探索努力とラピッドプロトタイピング^{12,13,14,15 または少量の水滴で当たり反応を実行する能力 ,16}。これらの利点は、システムのプラグ アンド プレイの性質の結果として当たりが一意に溶けてエクスプレス体内しにくいタンパク質の生産などのバイオ テクノロジーのアプリケーションのさまざまなを有効に^{17、 18,19,20}, 疾患^21,22,23, 需要製造^{18,24 の検出、25,26,27}、および教育^28,29、柔軟性と携帯無料プラットフォームのユーティリティを表示します。

CFPS システムは様々 な原核生物と真核生物の細胞から粗野な lysates から生成できます。これにより、対象のアプリケーションによって一長一短があるそれぞれの選択のシステムで多様なオプション。CFPS システムは準備時間、コスト、および生産性にも大きく異なります。最も一般的エキス、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、昆虫細胞、大腸菌細胞、後者はタンパク質^{30 の最高の容積の生産に最も費用対効果されてから生成されるセルを活用}.他の当たりのシステムはその生得的な翻訳後修飾機械に有利であるが、新興の大腸菌を使用してアプリケーション-ベース機械が生成 site-specifically リン酸化によってギャップを埋めることができると需要^{31,32,33,34,35}の糖蛋白質。

株当たりの反応は、いずれかのバッチ、連続交換携帯無料 (展) または連続的なフロー セル無料 (CFCF) 形式で実行できます。バッチ形式は、その反応の有効期間は反応物と反応の抑制の副産物の蓄積の減少量により制限クローズド システムです。展と CFCF 方法、反応の寿命を延ばすし、それによってバッチ反応と比較して増加した体積蛋白質収量の結果します。これは、新しい反応の反応²コース全体で供給している反応容器から削除するタンパク質合成の副産物を許可するで。CFCF の場合は、反応室、展、半透膜^36,37から成る反応室のままに興味の蛋白質の中から興味の蛋白質を削除できます。これらのメソッドは特に関心^{38,39,40,41,42、エクスプレス難しいタンパク質の低体積収率を克服するための貴重です 43}。展と CFCF アプローチの実装の課題は、1) 一方、彼らは転写と翻訳を担当バイオ機械のより効率的な使用の結果、特に大きい増加の全体的なコストと 2 試薬量が必要)複雑な反応セットアップとバッチ形式⁴⁴と比較して特殊な装置が必要です。新しいユーザーのためのアクセシビリティを確保するためにプロトコルに記載フォーカス ミリリットル スケールの反作用ボリュームを増加させるための特定の推奨事項 15 μ L の反応ボリュームでバッチ形式で。

記載方法は、細胞増殖を実装、エキスの準備、および、エシェリヒア属大腸菌の形式反応セットアップをバッチ (学生) など基本的な実験技術と非専門家を有効にする-ベースの当たりシステム。この方法は、反応のキット ベース セットアップの容易さを損なうことがなく市販のキットと比較して費用対効果です。さらに、このアプローチにより、アプリケーション実験室およびフィールド。当たりを実装するかを決める、新しいユーザーする必要があります当たりはすべてのケースで優れてはないかもしれないスタートアップ投資の従来の蛋白質の表現システムの有効性を評価徹底的に。ここで説明 CFPS 方法機能ゲノミクス、高スループット テスト、フィールドと同様に、体内式の扱いやすいタンパク質の生産を含む、アプリケーションのさまざまなを直接実装するユーザーを有効にします。バイオ センサー、合成生物学の教育キットを含むアプリケーション。代謝工学などの追加アプリケーション チューニングのタンパク質式条件、病気の検出、およびスケール アップを使用して展または CFCF メソッドはまだ可能ですが、さらに反応の編集 CFPS プラットフォームとの経験があります条件。我々 の方法は、超音波処理、次に最適化されたプレミックス⁴⁵を利用して簡易 CFPS 反応セットアップを介してセル換散の比較的迅速かつ再現性のある方法と成長リッチなメディアと困惑してフラスコを組み合わせます。細胞の増殖方法はややこのフィールド内で標準化になるが、セル換散方法が異なります。一般的な換散方法のほか超音波、フレンチ プレス、ホモジナイザー、ビーズ ビーターやリゾチーム、他生化学的および物理的な中断方法^46,47,48,の利用⁴⁹。 私たちのメソッドを使用すると、セルの 1 L あたり原油細胞抽出液の約 2 mL が得られます。細胞抽出液のこの量は 400 をサポートできる 15 μ L 当たり反応、各生産 〜 900 μ g/mL テンプレート プラスミドの pJL1 sfGFP から記者 sfGFP 蛋白質の。この方法で費用 $0.021/μ g sfGFP 生産 ($.019/μ L 反応)、労働および機器 (補足図 1) のコストを除きます。スクラッチから始めて、このメソッドは、一人で 4 日間で実装することができ、CFPS 反応時間 (図 1) 以内に完了することができますを繰り返します。さらに、ユーザーのニーズに合わせて試薬調製の大きなバッチ量プロトコルを拡張できます。重要なは、それだけ基本的な実験技術を必要とは、ここで提示されたプロトコルを訓練所の非専門家、学生などによって実装できます。以下に説明する手順とそれに伴うビデオは、特に広範な使用のためのエシェリヒア属大腸菌株当たりプラットフォームのアクセシビリティを改善するために開発されています。