Escherichia coli-base de la synthèse protéique acellulaire : protocoles pour une technologie de plate-forme robuste, flexible et accessible

Synthèse de protéine acellulaire (CFPS) a émergé comme une technologie qui a débloqué un certain nombre de nouvelles opportunités pour la production de protéines, génomique fonctionnelle, génie métabolique et plus encore dans les derniers 50 ans^1,2. Par rapport à la norme en vivo plates-formes expression de protéine, CFPS offre trois avantages principaux : 1) la nature acellulaire de la plate-forme permet la production de protéines qui seraient potentiellement toxiques ou étrangers à la cellule^{3,4 ,5,6}; 2) inactivation de l’ADN génomique et la mise en place d’un modèle d’ADN codant le gène d’intérêt canaliser toute l’énergie systémique au sein de la réaction à la production des ou des protéines d’intérêt ; et 3) la nature ouverte de la plate-forme permet à l’utilisateur de modifier et de surveiller les conditions de la réaction et la composition en temps réel^7,8. Cet accès direct à la réaction prend en charge l’augmentation des systèmes biologiques avec des chimies élargis et conditions redox pour la production de nouvelles protéines et l’accordage des processus métaboliques^{2,9, 10}. direct access permet également l’utilisateur de combiner la réaction de PFC avec tests d’activité dans un système single-pot des cycles de conception-construction-test plus rapide¹¹. La capacité à effectuer la réaction de PFC dans les gouttelettes de faible volume ou sur appareils sur papier plus soutient les efforts de découverte de haut débit et de prototypage rapide^{12,13,14,15 ,},¹⁶. À la suite de ces avantages et de la nature de plug-and-play du système, CFPS unique a permis à une variété d’applications de biotechnologie telles que la production de protéines qui sont difficilement soluble express en vivo^{17, 18,19,20}, détection des maladies^21,22,23, sur demande la biofabrication^{18,24 ,25,26,27}et l’éducation^28,29, qui montrent la flexibilité et l’utilité de la plate-forme acellulaire.

Systèmes de PFC peuvent provenir d’une variété de lysats bruts de deux lignées de cellules procaryotes et eucaryotes. Cela permet diverses options dans le système de choix, chacun d’entre eux ont des avantages et inconvénients selon l’application des intérêts. Systèmes de CFPS varient également considérablement en productivité, coût et temps de préparation. Le plus couramment utilisé cellule extraits sont produites à partir de germe de blé, réticulocytes de lapin, des cellules d’insecte et cellules d’Escherichia coli , cette dernière étant la plus efficace à ce jour tout en produisant le meilleur rendement volumétrique de la protéine³⁰ . Alors que les autres systèmes de PFC peuvent être avantageux pour leurs machines de modification post-traductionnelle innée, nouvelles applications à l’aide de l’ e. coli-machines basé sont en mesure de combler le fossé en générant relativement phosphorylée et protéines glycosylées sur demande^{31,32,33,34,35}.

Réactions de PFC peuvent être exécutées dans chaque lot, échange continu acellulaire (CECF) ou acellulaire (CFCF) formats de flux continu. Le format de lot est un système fermé, dont vie de réaction est limitée en raison de la diminution des quantités de réactifs et l’accumulation des sous-produits inhibiteurs de la réaction. Méthodes CECF et CFCF augmentent la durée de vie de la réaction et ainsi entraînent des rendements de protéine volumétrique accrue par rapport à la réaction de lot. Ceci est accompli en autorisant les sous-produits de la synthèse protéique à être retiré de la cuve de réaction alors que nouveaux réactifs sont fournis tout au long de la réaction². Dans le cas de la CFCF, la protéine d’intérêt peut également être retirée de la chambre de réaction, tandis que dans la CECF, la protéine d’intérêt demeure dans la chambre de réaction, composé d’une membrane semi-perméable^36,37. Ces méthodes sont particulièrement utiles pour surmonter les piètres rendements volumétriques de difficile-à-express des protéines d’intérêt^{38,39,40,41,42, 43}. Les difficultés à mettre en œuvre les approches CECF et CFCF sont que 1) alors qu’ils se traduire par une utilisation plus efficace des machines bio responsable de la transcription et la traduction, ils exigent notamment de plus grandes quantités de réactifs, ce qui augmente le coût global et 2) ils nécessitent des configurations plus complexes de réaction et d’équipements spécialisés par rapport à la lot format⁴⁴. Afin d’assurer l’accessibilité pour les nouveaux utilisateurs, les protocoles décrits se concentrer sur le format de traitement par lots à des volumes de réaction de 15 µL avec des recommandations précises pour augmenter le volume de réaction à l’échelle de millilitre.

Les méthodes présentées ici permettent profanes avec des compétences de laboratoire de base (telles que les étudiants de premier cycle) à mettre en œuvre la croissance cellulaire, extrait préparation et format réaction configuration de lot pour un e. coli-système de PFC. Cette approche est rentable par rapport aux kits disponibles dans le commerce sans sacrifier la facilité d’installation basé sur kit de réaction. En outre, cette approche permet aux applications en laboratoire et sur le terrain. Lorsque vous décidez de mettre en œuvre des produits forestiers certifiés, nouveaux utilisateurs devraient évaluer soigneusement l’efficacité des systèmes d’expression de protéine conventionnelle pour l’investissement de démarrage, comme le PFC n’est peut-être pas supérieure dans tous les cas. Les méthodes CFPS décrites ici permettent à l’utilisateur d’appliquer directement une variété d’applications, y compris la génomique fonctionnelle, haut débit stable, la production de protéines qui sont insolubles pour in vivo de l’expression, mais aussi de champ applications, y compris les biocapteurs et trousses pédagogiques pour la biologie synthétique. Des applications supplémentaires, tels que l’ingénierie métabolique, tuning des conditions d’expression de protéine, détection de la maladie et mesurent-vers le haut à l’aide des méthodes CECF ou CFCF sont toujours possibles mais peuvent exiger l’expérience avec la plateforme PFC pour une modification supplémentaire de la réaction conditions. Nos méthodes de conjuguer croissance en milieux enrichis et flacons déroutés, et des méthodes relativement rapides et reproductibles de la lyse cellulaire par le biais de la sonication, suivie d’une configuration de réaction CFPS simplifiée qui utilise des prémélanges optimisé⁴⁵. Même si les méthodes de croissance cellulaire ont devenu quelque peu normalisées dans ce domaine, procédés de lyse cellulaire varient considérablement. En plus de la sonication, les méthodes de lyse courantes sont utilisation d’une presse Français, un homogénéisateur, batteurs de perle, ou lysozyme et autres perturbations biochimiques et physiques méthodes^{46,47,48, 49}. à l’aide de nos méthodes, environ 2 mL d’extrait cellulaire brut sont obtenus par 1 L de cellules. Cette quantité d’extrait cellulaire peut prendre en charge quatre cents réactions de CFPS 15 µL, chaque producteur ~ 900 µg/mL de protéine sfGFP journaliste du plasmide de modèle pJL1-sfGFP. Cette méthode coûte $ 0,021/µg de sfGFP produit ($.019/µL de réaction), à l’exclusion du coût du travail et des équipements (la Figure 1). À partir de l’éraflure, cette méthode peut être implémentée en 4 jours par une seule personne et répétez les réactions PFC peuvent être complétées en heures (Figure 1). En outre, le protocole peut être transposé en volume pour les plus gros lots de préparation du réactif aux besoins de l’utilisateur. Ce qui est important, le protocole présenté ici peut être implémenté par laboratoire formé profanes tels que les étudiants de premier cycle, comme elle exige seulement des compétences du laboratoire de base. Les procédures décrites ci-dessous et la vidéo qui l’accompagne ont été spécifiquement développés pour améliorer l’accessibilité de la plate-forme de PFC d’e. coli pour une utilisation large.