Escherichia coli-base della sintesi proteica Cell-Free: protocolli per la tecnologia della piattaforma robusta, flessibile e accessibile

Sintesi di proteine senza cellula (CFPS) è emerso come una tecnologia che ha sbloccato una serie di nuove opportunità per la produzione di proteine, genomica funzionale, ingegneria metabolica e più entro gli ultimi 50 anni^1,2. Rispetto alla standard in vivo piattaforme di espressione di proteine, CFPS offre tre vantaggi principali: 1) la natura senza cellula della piattaforma consente la produzione di proteine che sarebbe potenzialmente tossici o stranieri per la cella^{3,4 ,5,6}; 2) inattivazione di DNA genomic e l’introduzione di un modello di DNA codificante il gene di interesse canale tutta l’energia sistemica all’interno della reazione per la produzione della proteina di interesse; e 3) la natura aperta della piattaforma consente all’utente di modificare e monitorare le condizioni di reazione e la composizione in tempo reale^7,8. Questo accesso diretto alla reazione supporta l’incremento dei sistemi biologici con composizioni chimiche espanse e condizioni redox per la produzione di nuove proteine e la messa a punto di processi metabolici^{2,9, 10}. diretto accesso consente inoltre all’utente di combinare la reazione CFPS con analisi di attività in un sistema singolo-pot per cicli di test per la compilazione di una progettazione più rapida¹¹. La capacità di eseguire la reazione CFPS nelle goccioline di piccolo volume o su dispositivi basati su carta maggiori azioni di alto-rendimento individuazione di supporti e prototipazione rapida^{12,13,14,15 ,16}. A seguito di questi vantaggi e la natura di plug and play del sistema, CFPS ha permesso in modo univoco una varietà di applicazioni della biotecnologia come la produzione di proteine che sono difficilmente solubile veloce in vivo^{17, 18,19,20}, rilevamento di^22,21,malattia²³, sulla domanda bioproduzione^{18,24 ,25,26,27}e formazione^28,29, i quali mostrano la flessibilità e l’utilità della piattaforma senza cellula.

Sistemi di CFPS possono essere generati da una varietà di greggio lisati da entrambe le linee cellulari procarioti ed eucarioti. Questo permette diverse opzioni nel sistema di scelta, ciascuno dei quali hanno vantaggi e svantaggi a seconda dell’applicazione di interesse. CFPS sistemi variano anche notevolmente in produttività, costi e tempi di preparazione. La maggior parte utilizzati comunemente cella estratti sono prodotti da germe di grano, dei reticolociti di coniglio, cellule di insetto e cellule di Escherichia coli , con quest’ultimo è il più redditizio per data, producendo il massimo rendimento volumetrico della proteina³⁰ . Mentre altri sistemi CFPS possono essere vantaggiosi per le loro macchine di modificazione post-traduzionale innata, emergendo applicazioni utilizzando il e. coli-base macchine sono in grado di colmare il divario generando site-specifically fosforilato e proteine glicosilate su domanda^{31,32,33,34,35}.

Le reazioni CFPS possono essere eseguite in entrambi batch, scambio continuo senza cellula (CECF) o flusso continuo senza cellula (CFCF) formati. Il formato di batch è un sistema chiuso in cui durata di reazione è limitata a causa della diminuzione quantità di reagenti e l’accumulazione dei sottoprodotti inibitori della reazione. Metodi CECF e CFCF aumentano la durata della reazione e quindi causare rendimenti volumetrici aumentata della proteina rispetto alla reazione batch. Questa operazione viene eseguita consentendo i sottoprodotti della sintesi proteica per essere rimosso dal recipiente di reazione, mentre nuovi reagenti sono forniti nel corso della reazione². Nel caso di CFCF, la proteina di interesse può essere rimosso anche dalla camera di reazione, mentre in CECF, la proteina di interesse rimane nella camera di reazione, costituito da una membrana semi-permeabile^36,37. Questi metodi sono particolarmente preziosi nel superare la scarsa resa volumetrica di difficile–express proteine di interesse^{38,39,40,41,42, 43}. Le sfide nell’attuazione degli approcci CECF e CFCF sono che 1) mentre risultano in un uso più efficiente dell’apparato bio responsabile della trascrizione e traduzione, richiedono in particolare più grandi quantità di reagenti che aumenta il costo complessivo e 2) Essi richiedono configurazioni più complesse di reazione e attrezzature specializzate rispetto al lotto formato⁴⁴. Al fine di garantire l’accessibilità per i nuovi utenti, i protocolli descritti qui messa a fuoco sul formato batch a volumi di reazione di 15 µ l con raccomandazioni specifiche per aumentare il volume di reazione per la scala di millilitro.

I metodi presentati qui abilitare non esperti con competenze di base di laboratorio (ad esempio studenti universitari) per implementare la crescita delle cellule, estrarre preparazione e installazione di reazione formato in batch per un e. coli-CFPS sistema basato. Questo approccio è conveniente rispetto ai kit disponibili in commercio senza sacrificare la facilità di installazione basato su kit di reazione. Inoltre, questo approccio consente alle applicazioni in laboratorio e in campo. Quando si decide di implementare CFPS, nuovi utenti dovrebbero valutare attentamente l’efficacia di sistemi di espressione di proteine convenzionali per investimento per l’avvio, come CFPS non può essere superiore in ogni caso. I metodi CFPS qui descritti consentono all’utente di implementare direttamente una varietà di applicazioni, tra cui la genomica funzionale, test, la produzione di proteine che sono insolubili per espressione in vivo , come pure il campo ad alta velocità applicazioni tra cui biosensori e kit didattici per biologia sintetica. Le applicazioni aggiuntive come ingegneria metabolica, ottimizzazione delle condizioni di espressione della proteina, individuazione della malattia e scalabilità utilizzando metodi CECF o CFCF sono ancora possibili ma possono richiedere l’esperienza con la piattaforma CFPS per ulteriori modifiche della reazione condizioni. I nostri metodi di combinano una crescita in media arricchita e boccette sconcertati, con metodi relativamente rapidi e riproducibili di lisi cellulare mediante sonicazione, seguita da un’installazione di reazione CFPS semplificata che utilizza ottimizzato premiscele⁴⁵. Mentre i metodi di crescita cellulare sono diventati un po’ standardizzati all’interno di questo campo, metodi per lisi cellulare variano ampiamente. Oltre a sonicazione, metodi di lisi comuni includono l’utilizzo di una pressa francese, un omogeneizzatore, battitori della perla, o lisozima e altri disagi fisici e biochimici metodi^{46,47,48, 49}. usando i nostri metodi, circa 2 mL di estratto grezzo delle cellule sono ottenute per 1 L di cellule. Questa quantità di Estratto di cellule in grado di supportare quattro cento 15 µ l CFPS reazioni, ogni produzione ~ 900 µ g/mL di proteina sfGFP reporter dal plasmide modello pJL1-sfGFP. Questo metodo costa $0,021 / µ g di prodotto sfGFP ($.019/microlitro di reazione), escluso il costo della manodopera e le attrezzature (Supplemental figura 1). A partire da zero, questo metodo può essere implementato in 4 giorni da una sola persona e ripetere le reazioni CFPS possono essere completate entro le ore (Figura 1). Inoltre, il protocollo può essere scalato in volume per grandi lotti di preparazione dei reagenti in base alle esigenze dell’utente. D’importanza, il protocollo qui presentato può essere implementato da laboratorio addestrato non-esperti quali studenti universitari, come richiede solo la capacità di laboratorio di base. Le procedure descritte di seguito e il video di accompagnamento sono stati specificamente sviluppati per migliorare l’accessibilità della piattaforma CFPS Escherichia coli per l’ampio utilizzo.