Escherichia coli-base libres de células síntesis de la proteína: protocolos para una tecnología de plataforma robusta, flexible y accesible

Síntesis de proteína sin células (PFC) ha emergido como una tecnología que ha abierto un número de nuevas oportunidades para la producción de proteínas, genómica funcional, ingeniería metabólica y más en los últimos 50 años^1,2. En comparación con el estándar en vivo plataformas de expresión de la proteína, PFC proporciona tres ventajas fundamentales: 1) la naturaleza libre de la plataforma permite la producción de proteínas que serían potencialmente tóxicas o ajenas a la célula^{3,4 ,5,6}; 2) inactivación de la DNA genomic y la introducción de una plantilla de DNA que codifican los genes de interés canalizar toda la energía sistémica dentro de la reacción a la producción de la proteína de interés; y 3) el carácter abierto de la plataforma permite al usuario modificar y supervisar las condiciones de reacción y composición en tiempo real^7,8. Este acceso directo a la reacción es compatible con el aumento de los sistemas biológicos químicos ampliados y condiciones redox para la producción de nuevas proteínas y la afinación de procesos metabólicos^{2,9, 10}. directa acceso también permite al usuario combinar la reacción de PFC con ensayos de actividad en un sistema del solo-pot para ciclos de diseño-construcción-prueba más rápida¹¹. La capacidad para realizar la reacción de PFC en gotas de pequeño volumen o en los dispositivos basados en papel más apoya esfuerzos de descubrimiento de alto rendimiento y prototipado rápido^{12,13,14,15 ,16}. Como resultado de estas ventajas y la naturaleza de listo del sistema, PFC únicamente ha permitido una variedad de aplicaciones de la biotecnología como la producción de proteínas que son difíciles de expresar soluble en vivo^{17, 18,19,20}, detección de la enfermedad^21,22,23, en demanda de biofabricación de^{18,24 ,25,26,27}y educación^28,29, todos los cuales muestran la flexibilidad y la utilidad de la plataforma libre de células.

Sistemas de PFC pueden ser generados desde una gran variedad de lisados crudos de ambas variedades de células procariotas y eucariotas. Esto permite diversas opciones en el sistema de elección, cada uno de los cuales tiene ventajas y desventajas dependiendo de la aplicación de interés. Sistemas de PFC también varían mucho en productividad, costo y tiempo de preparación. Los más comúnmente utilizan celular se producen extractos de germen de trigo, reticulocitos de conejo, células de los insectos y células de Escherichia coli , siendo esta última la más rentable hasta la fecha mientras que produce los mayores rendimientos volumétricos de la proteína³⁰ . Mientras otros sistemas de PFC pueden ser ventajosos para su maquinaria de modificación poste-de translación innata, surgiendo aplicaciones utilizando e. coli-maquinaria base son capaces de cerrar la brecha mediante la generación de site-specifically fosforilada y proteínas glicosiladas en demanda^{31,32,33,34,35}.

Reacciones de PFC se pueden ejecutar en cualquier lote, continuo intercambio sin células (CECF) o flujo continuo sin células (CFCF) formatos. El formato por lotes es un sistema cerrado cuya reacción es limitada debido a la disminución de cantidades de reactivos y la acumulación de subproductos inhibitorios de la reacción. Métodos CECF y CFCF aumentan la vida útil de la reacción y así dar lugar a rendimientos volumétricos creciente de la proteína en comparación con la reacción de lote. Esto se logra permitiendo que los subproductos de la síntesis de la proteína debe sacar el recipiente de la reacción mientras que nuevos reactivos se suministran en el transcurso de la reacción². En el caso de CFCF, la proteína de interés también puede removerse de la cámara de reacción, mientras que en la CECF, la proteína de interés permanece en la cámara de reacción compuesta por una membrana semipermeable^36,37. Estos métodos son especialmente valiosos para superar los bajos rendimientos volumétricos de difícil-a-expresan proteínas de interés^{38,39,40,41,42, 43}. Los desafíos en la implementación de los enfoques CECF y CFCF son 1) mientras que resultan en un uso más eficiente de la maquinaria de la bio responsable de la transcripción y traducción, que requieren en particular grandes cantidades de reactivos que aumenta el costo general y 2) requieren más complejas configuraciones de reacción y equipo especializado en comparación con el formato de lote⁴⁴. Con el fin de garantizar la accesibilidad para los nuevos usuarios, los protocolos describen foco en el formato por lotes en volúmenes de reacción de 15 μl con recomendaciones específicas para aumentar el volumen de reacción a la escala de mililitro.

Los métodos presentados en este documento permiten no expertos con habilidades básicas de laboratorio (como estudiantes) para implementar el crecimiento celular, preparación del extracto y formato reacción configuración de lote para una e. coli-basado sistema de PFC. Este enfoque es rentable en comparación con los kits disponibles en el mercado sin sacrificar la facilidad de la instalación de reacción basado en el kit. Además, este enfoque permite a las aplicaciones en el laboratorio y en el campo. Cuando se decide implementar PFC, nuevos usuarios completamente deben evaluar la eficacia de los sistemas de expresión de la proteína convencional para la inversión de arranque, como PFC no puede ser superior en todos los casos. Los métodos de PFC aquí descritos permiten al usuario aplicar directamente una variedad de aplicaciones, incluyendo la genómica funcional, la producción de proteínas que son insuperables para expresión en vivo , así como campo de prueba de alto rendimiento aplicaciones como biosensores y kits educativos para la biología sintética. Aplicaciones adicionales tales como la ingeniería metabólica, de las condiciones de expresión de la proteína, detección de enfermedades y escalado utilizando métodos CECF o CFCF siguen siendo posibles pero pueden requerir experiencia con la plataforma de PFC más modificación de la reacción condiciones. Nuestros métodos de combinan crecimiento en medios enriquecidos y el desconcertado, con métodos relativamente rápidos y reproducibles de lisis celular mediante sonicación, seguido por una configuración simplificada de reacción de PFC que utiliza mezclas optimizadas⁴⁵. Mientras que los métodos de crecimiento celular han convertido en algo estandarizados dentro de este campo, métodos de lisis celular varían ampliamente. Además de sonicación, métodos de lisis comunes incluyen la utilización de una prensa francesa, un homogeneizador, batidores de grano, o lisozima y otras perturbaciones bioquímicas y físicas métodos^{46,47,48, 49}. nuestros métodos, se obtienen aproximadamente 2 mL de extracto crudo de la célula por 1 L de las células. Esta cantidad de extracto celular puede soportar 400 15 μl PFC reacciones, cada producción ~ 900 μg/mL de proteína de sfGFP de reportero de la plantilla de plásmido pJL1-sfGFP. Este método cuesta $ 0,021/μg de sfGFP producido ($.019/μl de reacción), excluyendo el costo de mano de obra y equipo (suplementario Figura 1). A partir de cero, este método puede aplicarse en 4 días por una sola persona y repetir reacciones PFC pueden completarse dentro de las horas (figura 1). Además, el protocolo puede ser aumentado en volumen para lotes más grandes de preparación de los reactivos para satisfacer las necesidades del usuario. Lo importante es el protocolo que presentamos se puede implementar laboratorio entrenado no expertos como estudiantes, ya que sólo requiere conocimientos básicos de laboratorio. Los procedimientos descritos a continuación y el video que lo acompaña han sido desarrollados específicamente para mejorar la accesibilidad de la plataforma de PFC de e. coli de amplio uso.