In Vitro Arranhar o ensaio para demonstrar os efeitos de arsênico na migração de células de pele

1. preparação de um gabinete de biossegurança II (BSC) Nota: Os métodos descritos no presente protocolo devem ser realizados com equipamento de proteção pessoal, durante o uso de boas práticas laboratoriais para alcançar uma técnica asséptica. Levante o vidro protetor do BSC a altura operacional e ligar ventiladores de fluxo laminar. Use 70% solução aquosa de isopropanol para executar um apagamento de saneamento da área de trabalho. Limpe o BSC da parede do fundo e paredes laterais e trabalhar até a placa de base. Limpe todos os materiais que serão utilizados no ensaio com 70% de álcool (isopropanol ou EtOH) e colocá-las dentro do BSC. 2. humanos fibroblastos dérmicos semeadura em balão T75 Obter os frascos com a linha de celular criopreservado desejado (neonatais humanas fibroblastos dérmicos [hDFn], a concentração de células de 500.000 células/frasco e na passagem p3-p5). Coloque um tubo de ensaio com células em 1,0 cm de profundidade banho-maria a 37 ° C, para permitir que o descongelamento. Descongele o frasco até que aproximadamente 70% de solução de célula é líquido. Limpe bem o frasco com álcool a 70% e coloque o frasco em rack frasco dentro do BSC.Nota: Certifique-se de água não entra em contato com tópicos ou tampa do frasco para evitar a contaminação potencial durante a semeadura de célula. Evitar descongelar completa de células na água do banho como a não observância pode causar morte celular não-intencional. Tirar 10 mL de mídia suplementada com 10% de soro Fetal bovino (FBS). Use uma pipeta automática e a ponta da pipeta de 10 mL para aspirar T75 balão de cultura de tecidos. Permitir que a mídia totalmente saturar a base do frasco, agite suavemente o frasco para a frente e para trás. Frasco aberto com solução de estoque e aspirado de célula do frasco, sendo consciente de pipetagem de velocidade, como as membranas celulares estará vulnerável de criopreservação. Transferência de células para um balão de tecido T75 com mídia. Ejete célula descongelada para balão de tecido, novamente estar consciente de pipetagem de velocidade.Nota: Semeando a densidade das células em balão de tecido é aproximada para ser 6.600 células/cm2. Densidade de semeadura pode ser alterado para acomodar o usuário e o tempo desejado de experimentação. Meça 1 mL de mídia do balão de tecido T75 e transferir volume de volta para o frasco. Transferi o volume do frasco volta para o balão de T75.Nota: Executar este passo ajuda a maximizar o rendimento da célula do frasco. Aperte a tampa do frasco de cultura de tecidos e agitar suavemente para dispersar uniformemente as células em suspensão através de toda a superfície. Verifique se há uma distribuição uniforme de células usando um microscópio invertido. Balão de rótulo com o tipo de célula, data, iniciais, linhagem e finalidade (por exemplo, hDFn, 11/07/2018, NDC, passagem 4, arsénio Scratch ensaio). Coloque o frasco de cultura do tecido em uma incubadora umidificada a 37 ° C e 5,0% de CO2 por 72 h.Nota: Meio de crescimento deve ser alterado 12-24 h após a semeadura inicial para remover vestígios de Dimetilsulfóxido (DMSO) cryopreservative e então mudou a cada 48 h após o que, para garantir que as células são adequadamente nutridas. O período de incubação e crescimento dependerá o número estimado de células necessárias para o ensaio de zero. O tempo de duplicação para as células hDFn é normalmente 16-24 h em condições normais. No entanto, duplicação da taxa pode mudar devido à elevação, pH, temperatura, umidade, tipo médio, etc.e deve ser contabilizada no planejamento de experimentos. 3. contagem de células e subcultura em tecido 12-poços cultura placa Recupere o frasco de cultura de tecidos de T75 da incubadora. Observar células aderidas, usando um microscópio invertido no objetivo ampliação de 10x (aumento total X 100) e determinar a confluência de célula aproximada. Varredura da maioria do frasco de cultura de tecidos quando observar a confluência para garantir a percentagem mais representativa é aproximada. Avalie a morfologia da célula individual para qualquer anormalidade, ou por contaminação bacteriana ou fúngica. Monte a pipeta automática com uma ponta de pipeta de 10 mL. Use a pipeta para aspirar todo o volume de mídia da solução T75 e transferir para um contentor de resíduos. Evitar que a ponta da pipeta entrar em contato com a superfície aderente da célula. Descarte a ponta da pipeta em um escaninho de risco biológico. Monte a pipeta automática com uma ponta de pipeta de 5 mL. Aspire 5 mL da solução de sal equilibrada, dispense o frasco e agitar suavemente o frasco para lavar o excesso mídia, células mortas e resíduos de produto. O volume a retirar o T75 e dispense dentro do recipiente para resíduos. Descarte a ponta da pipeta para o lixo de risco biológico. Monte a pipeta automática com um adaptador de pipeta de 5 mL. Aspirar 2 mL de tripsina do estoque, dispense o frasco e agitar suavemente o frasco para dispersar a enzima sobre as células aderidas. Assegure a saturação completa da superfície aderente. Coloca o balão de tecido na incubadora durante 2-3 minutos (min).Nota: A reação enzima-substrato máxima não deve exceder 10 min. Observe o balão de tecido sob um microscópio invertido em uma ampliação da lente objetiva de 10x (aumento total X 100). Aplica vibrações suaves para facilitar o desprendimento de células. Limpe o frasco T75 com álcool a 70% e coloque dentro do BSC. Monte a pipeta automática com uma ponta de pipeta de 5 mL. Aspire 5 mL de mídia do estoque e adicionar no balão de tecido T75 para parar a reação enzima-substrato. A relação da mídia: tripsina deve ser de 3:1. Pipeta acima e abaixo da base do balão de 2 – 3 vezes para enxaguar e certifique-se de que a reação parou. Aspire o volume total de líquido do frasco e transferir para um tubo cônico estéril 15 mL. Encha um segundo tubo cônico de 15 mL com um volume idêntico de mídia. Coloque ambos os tubos cônico de 15 mL em posição antipodal um ao outro. Aplica 200 g da força centrífuga para min 5 a 25° C, definindo parâmetros de funcionamento do equipamento. Limpe o tubo cônico de 15 mL com células peletizadas com álcool a 70% e coloque dentro do BSC. Use a pipeta automática com uma ligação de 5 mL com pipeta fora da mídia, deixando para trás cerca de 250 µ l de fluido e célula da pelota. Preste atenção à posição da ponta da pipeta, como o centrifugado deve permanecer intacto. Distribuir o volume coletado em um recipiente de resíduos e descarte a ponta em um escaninho de risco biológico. Use um rack de tubo microcentrifuga para executar o fundo do tubo cónico através das ranhuras do frasco, criando uma vibração rápida, para perturbar e ressuspender o centrifugado (às vezes chamado de “bastidor de ajuntar”).Nota: Evite usar um misturador do vortex para executar essa etapa. As forças de gravidade criadas por misturadores de vórtice excederem os limiares de força-g célula e podem causar a Lise. Quando concluída corretamente, a nova solução de célula aparecerá como uma mistura nublada com nenhuma pelota restante. Diligência, executar este passo muitas vezes irá criar uma suspensão única célula, levando a maior precisão, quando a contagem de células. Adicione 2 mL de mídia a ressuspensão ou das células. Pipetar as células suavemente para baixo do lado do tubo 20 vezes para quebrar qualquer touceiras. Registrar o volume de suspensão celular total e reserve brevemente. Pipetar 20 µ l de estoque azul Trypan (0,4%) em um poço vazio de uma placa de 96 poços, usando uma pipeta estéril. Misture a solução de estoque celular para gerar uma suspensão uniforme de células antes da transferência. Use uma ponta de pipeta estéril para remover 20 µ l de caldo de célula (evitando tocar as paredes do tubo). Adicione a 20 µ l de solução de azul de Trypan na placa de 96 poços. Pipeta suavemente para misturar o conteúdo. Pipeta de 10 µ l da mistura entre a lamínula e a contagem de câmara sobre o hemocytometer. Observe as células e a grade sob um objetivo X 10. Observe nove grandes praças dentro do campo de visão. Contar as células apenas no centro e 4 quadrados de canto (total de 5 quadrados).Nota: Procure uma distribuição uniforme de células em toda a rede inteira para garantir uma contagem exata. Concordância de todas as células (transparentes e azuis) em 5 quadrados identificados da grade. Calcular separadamente, apenas as células viáveis (azuis) as mesmas 5 quadrados. Calcule a contagem de células viáveis usando:onde x = contagem de células viáveis, um = células totais, b = células não-viáveis Calcule a densidade de células viáveis usando:onde x = densidade de células viáveis e y = soma total de células viáveis. Calcule o totais células viáveis:onde x = totais células viáveis, y = densidade de células viáveis, f = volume de suspensão de células (mL). Calcule a viabilidade celular de %:onde x = viabilidade celular por cento, y = células viáveis que contava com grade, f = totais células contadas na grade. Marque uma linha horizontal na parte inferior da placa 12-poços para servir como pontos de referência durante a imagem latente. Use a densidade de células viáveis (calculada em 3.3.7) para calcular o volume de mídia para diluir o estoque de célula em para uma placa de cultura de tecido 12-poços de propagação.Nota: A célula ideal semeando a densidade de células de hDFn é de 5.000 células/cm2. Diluir o estoque de célula para células/mL 19.000 usando mídia e sementes de cada poço com 1 mL de caldo de célula. Misture o estoque de célula periodicamente para assegurar mesmo célula semeadura em todos os 12 poços. Etiquete cada prato com o tipo de célula, a linhagem, as iniciais do usuário e da finalidade. Colocar placas na incubadora conjunto para 37 ° C e 5,0% de CO2. Permitir que as células a crescer até alcançar a confluência de 100% para o ensaio do zero. 4. arsénio (As) soluções estoque e cálculos Diluir o Arsenito de sódio (NaAsO2) diretamente em meios de cultura celular com 10% FBS nas concentrações de trabalho de 10, 1,0, 0,1 e 0,01 µM como. Para isso, fazer um estoque inicial 1mm como solução diluindo 3,9 mg de Arsenito de sódio em 30 mL de mídia. Serialmente dilua o estoque de 1 mM para as restantes como soluções. 1000 µM como estoque Cálculos Trabalhar ações concentrações de arsénio M1V1= M2V2 Volume de solução de arsênico anterior Volume de mídia Volume total de arsênico trabalhando Stock NaAsO2 molecular peso: 129.9 g/mol 10 µM como (x mL) (1.000 µM) = ()(10 µM) 30 mL x = 0,3 mL 0,3 mL = 300 µ l de 1mM, como solução mídia de 29,7 mL 30 .03 L x.001 mol/L x 130 g/mol = 3,9 mg de arsênico 1,0 µM como (x mL) (10 µM) = ()(1 µM) 30 mL x = 3 mL 3 mL de 10 µM como solução 27 mL de mídia 30 Diluir 3,9 mg de Arsenito de sódio em media de 30 mL 0.1 µM como (x mL) (1 µM) = ()(0.1 µM) 30 mL x = 3 mL 3 mL de 1 µM como 27 mL de mídia 30 0,01 µM como (x mL) (0,1 µM) = ()(0.01 µM) 30 mL x = 3 mL 3 mL de 0.1 µM como 27 mL de mídia 30 Tabela 1. Estoques de arsênico e diluições em série. Esta tabela explica os cálculos usados para criar As soluções estoque e trabalhando as soluções para os grupos de tratamento. 5. Raspe a técnica de ensaio e contaminação de arsênio Obter uma placa de 12 com células da incubadora. Ver as células em um 10 X ampliação objetiva (ampliação total X 100). Determine a confluência de célula dentro de cada poço.Nota: Cada indivíduo bem deve chegar a confluência de 100% antes de coçar. Esta etapa crítica garante a consistência dentro do ensaio e ajuda a padronizar protocolos do ensaio através de experimentos. Se qualquer poços não chegaram a confluência de 100%, permitem que as células incubar durante mais tempo, até que todos os poços chegaram a confluência de 100%. Tempo de crescimento adicional em poços que já atingiram 100% confluência não será afetado. Confluentes normalmente se tornará crescimento preso e permanecem como uma cultura de monocamada, permitindo sub confluentes poços atingir 100% de confluência. Monte uma pipeta automática com uma ponta de pipeta de 10 mL. Aspire a mídia de crescimento fora de todos os poços. Elimine o volume de resíduos líquidos e a ponta da pipeta no caixote do lixo de riscos biológicos. Monte uma p200 pipeta com uma ponta de estéril 1-200 µ l. Em cada poço, produzir um arranhão “ferida simulado” deslizando a ponta em toda a superfície da célula de um 12-horas para 6 horas local.Nota: Três fatores que afetarão extremamente consistência são velocidade, pressão e ângulo de ponta. O risco deve ser realizado rapidamente, com uma pressão constante, enquanto ser consciente do ângulo de ponta ficar perpendicular à base da placa. Coçar muito lentamente fará com linhas tortas, excesso de pressão pode permanentemente marcar superfícies aderente de célula e um ângulo de ponta inferior a 90° vai reduzir a largura zero. Qualquer um desses erros comuns pode resultar em taxas de migração alterada e padrões. Limpe touceiras de detritos e célula excesso enxaguando com 1 mL de solução salina equilibrada por bem. Rocha, a placa lateral-lateral para facilitar a lavagem. Remover a solução salina equilibrada de poços e descarte em um recipiente de resíduos. Elimine a ponta da pipeta de 5 mL para o lixo de riscos biológicos. Figura 1: representação esquemática do ensaio zero. Todo trabalho é feito dentro de um campo asséptico para diminuir a possibilidade de contaminação. As células são semeadas em uma densidade desejada em frascos de cultura de tecidos e crescidas em uma incubadora definida como humanas condições fisiológicas (5% de CO2, 37 ° C). Ao atingir uma confluência desejada, as células são assepticamente sub cultivadas em placas de cultura de tecidos de 12-poços em uma densidade de semeadura desejada. As células são cultivadas para a confluência de 100% em cada poço da placa 12-poços e riscado com uma ponta de pipeta estéril. Este “zero” cria uma em vitro simulado ferida (indicada pela seta de cabeça dupla), na qual células naturalmente migram para fechar a área aberta. Cada um bem pode ser excepcionalmente condicionado e taxas de migração celular podem ser observadas e quantificadas em resposta às condições de tratamento diferente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Use uma pipeta p1000 com uma ponta de 1.000 µ l para Pipetar 1.000 µ l dos estoques de arsênico em poços que foram atribuídos aleatoriamente com um grupo de tratamento. Use uma nova ponta da pipeta para cada poço para evitar contaminação cruzada. Registre o tempo quando os tratamentos são adicionados. Coloque placas boas 12 em uma incubadora a 37 ° C e 5,0% de CO2. 6. imaging Capture imagens de cada poço em 10 X ampliação objetiva cada 4h durante um período de 24 h (0, 4, 8, 12, 16, 20 e 24 h). A linha anteriormente desenhada na parte inferior da placa para o mesmo local ao longo do zero dentro de cada poço em pontos de tempo subsequente de imagem de referência.Nota: É imperativo que os mesmos locais são fotografados em cada ponto de tempo para permitir a análise de imagens precisas e obter dados representativos. 7. análise de imagens Upload de imagens capturadas sobre o microscópio invertido para um computador e salvar como uma imagem JPEG com um nome de arquivo detalhado. Abra o ImageJ. Upload de uma imagem de um micrômetro de palco com distâncias conhecidas para o software para converter pixels em milímetros (mm), quando a medição de imagem arrastando e soltando o arquivo para a janela do software.Nota: O micrômetro deve ter linhas que delimitam um conhecido de 1 mm de comprimento e a imagem deve ser tomada com a mesma ampliação usada para capturar imagens de células. Por exemplo, neste estudo imagens foram tiradas em 100 X ampliação total, assim, a imagem do micrômetro palco foi tirada em 100 X ampliação total. Clique nas opções reta, segmentadoou Linhas à mão livre . Desenhe uma linha de distância conhecida na imagem micrômetro usando as marcas de escala com um comprimento de associado para cada escala marcas. Desenhar uma linha reta: clique do mouse, segure, arraste o cursor para o local desejado e solte-se do mouse. Selecione analisar , em seguida, selecione Definir escala. Definir a Distância conhecida para o comprimento conhecido da linha desenhada na etapa anterior. Definir a unidade de comprimento para mm. Marque a caixa global. Selecione Okey para sair do menu. Feche a imagem de micrômetro de palco. Carregar uma imagem do ensaio zero em ImageJ arrastando e soltando o arquivo de imagem para a janela. Desenhe uma linha reta em toda a largura da risque (da esquerda de ponta a ponta direita). Pressione a letra M do teclado para registrar a medida da linha reta desenhada. Uma pequena janela de resultados aparecerá imediatamente depois de digitar a letra M. Isto é onde será a medição de largura. Repita a etapa 7.4 um total de 10 vezes para obter 10 medições ao longo do comprimento da risque.Nota: É importante gerar os valores de largura mais representativo do comprimento inteiro da risque. Certifique-se de espaço fora as medições de 10 largura igualmente ao longo do comprimento da risque de cima para baixo. Crie um arquivo de planilha do ensaio zero para copiar e colar as medições. Copie e cole as medições de 10 largura da janela de resultados na coluna apropriada em um arquivo de planilha (tabela 2).Nota: Quando as medições são copiadas a partir da janela de resultados e coladas em folha de cálculo, haverá estranhas colunas de valores; esses valores devem ser suprimidos, preservando apenas as medições de 10 largura. 10 medidas de largura aleatória 0 h 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Média de 10 medições Tabela 2. Medições de largura original formato de tabela. Esta tabela mostra a estrutura organizacional para as crus medidas obtidas. Repita os passos acima para o restante das imagens do ensaio zero. Calcule a média das 10 medições em cada ponto do tempo (0-24 h) para cada poço. Determine por cento encerramento cálculos usando valores da etapa 7,8. Criar uma tabela na parte inferior da planilha intitulado “médias de medição de largura” (tabela 3). Copiar e colar que a linha Média de 10 medições calculada no passo 7,8 na tabela “medição de largura média”. Crie outra mesa ao lado a tabela de Médias de medição de largura . Este título de mesa Fechamento de ferida por cento (tabela 4).Nota: O valor na coluna h 0 para cada poço deve ser 0 porque o zero é 0% fechado na foto inicial h 0 para todos os poços. Navegue até a próxima coluna sobre (4 h). Calcule o fechamento por cento para 4, 8, 12, 16, 20 e pontos de tempo de 24 h:onde, x = encerramento por cento, eu = largura zero inicial (largura h 0), f = largura zero final (4, 8, 12, 16, 20 ou 24 h largura). Bem largura médias 0 h 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h 1a 2a 3a 4a 1B 2B 3B 4B 1c 2c 3c 4c Tabela 3. Medição de largura média de formato de tabela. Esta tabela mostra a estrutura organizacional para as médias de medição de largura calculada utilizando as medições de largura original na tabela 2. Bem 0 h 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h 1a 0 2a 0 3a 0 4a 0 1B 0 2B 0 3B 0 4B 0 1c 0 2c 0 3c 0 4c 0 Tabela 4. Formato de tabela de encerramento da ferida por cento. Esta tabela mostra a estrutura organizacional para os valores de fechamento de ferida por cento calculado usando a medição de largura médias na tabela 3. Crie outra mesa ao lado da mesa de Encerramento de ferida por cento . Este título da tabela AUC (tabela 5). Calcular o 0-4 h área sob o valor de curva (AUC) no 0-4 coluna h para cada poço:onde x = 0-4 h valor AUC, um = o valor de fechamento % para h 0, b = valor de encerramento % por 4 h, h = o tempo entre as duas medidas (4 h neste estudo). Calcule a área de 4-8 h sob o valor de curva (AUC) na coluna 4-8 h para cada poço:Onde x = valor AUC 4-8 h, um = % valor de encerramento para 4h, b = valor de encerramento % para 8 h, h = o tempo entre as duas medidas (4 h neste estudo).Nota: Um valor AUC deve ser calculado para cada intervalo de tempo de 4 h, durante o período de 24 h para cada poço. Soma todos os valores AUC de 0-24 h (calculado em etapas 7.10.1-7.10.2) para obter um valor AUC somado para cada poço. Certifique-se que estes valores são salvos corretamente para análise estatística. Bem 0-4 h 4-8 h 8-12 h 12-16 h 16-20 h 20-24 h AUC resumiu 1a 2a 3a 4a 1B 2B 3B 4B 1c 2c 3c 4c Tabela 5. Formato de tabela AUC. Esta tabela mostra a estrutura organizacional para os valores AUC calculado usando o % ferida valores de encerramento na tabela 4. 8. análise estatística Determine o método de análise estatística que melhor se adapta o desenho experimental e somados valores AUC obtidas durante o ensaio.