In Vitro Rasguño de análisis para demostrar los efectos del arsénico sobre la migración de la célula de la piel

1. preparación de un gabinete de bioseguridad II (BSC) Nota: Los métodos descritos en este protocolo deben realizarse con equipo de protección personal, durante el uso de buenas prácticas de laboratorio para lograr una técnica aséptica. Levantar el cristal protector del BSC a la altura del funcionamiento y encienda los ventiladores de flujo laminar. Utilizar solución acuosa de isopropanol 70% para realizar un barrido de saneamiento de la zona de trabajo. Limpie el BSC de la pared del fondo y las paredes laterales y trabajo a la placa base. Limpie todos los materiales que se utilizarán en el ensayo con alcohol al 70% (isopropanol o EtOH) y colóquelas dentro de la BSC. 2. humanos fibroblastos dérmicos siembra en un matraz T75 Obtener frascos con la línea de células cryopreserved deseada (neonatales humanas fibroblastos dérmicos [hDFn], concentración celular de 500.000 células/vial y paso p3-p5). Colocar un frasco con las células en un baño María a 37 ° C para permitir la descongelación 1.0 cm de profundidad. Descongelar el vial hasta que aproximadamente el 70% de la solución celular es líquido. Limpie la parte vial con alcohol 70% y frasco en rack vial dentro de BSC.Nota: Asegúrese de agua no viene en contacto con los hilos de rosca o tapa del frasco para evitar la posible contaminación durante la siembra de la célula. Evitar la descongelación completa de las células en el agua del baño ya que no hacerlo puede causar muerte celular accidental. Extraer 10 mL de medio suplementado con 10% suero bovino Fetal (FBS). Utilice una pipeta automática y la punta de la pipeta de 10 mL para aspirar al matraz de cultivo de tejidos T75. Permitir que los medios de comunicación saturar completamente la base de la mufla, meciendo suavemente el frasco hacia adelante y hacia atrás. Frasco abierto con solución de stock y aspirado de células del frasco, siendo consciente de la velocidad de pipeteado, como membranas de la célula será vulnerables de criopreservación. Transferir las células a un matraz de tejido T75 con medios de comunicación. Expulsión de células descongeladas al matraz de tejido, otra vez siendo consciente de la velocidad de pipeteado.Nota: Siembra la densidad de células en matraz de tejido se aproxima para ser 6.600 células/cm2. Densidad de siembra puede ser modificado para adaptarse al usuario y deseado momento de experimentación. Medir 1 mL de medio frasco de tejido T75 y transferencia de volumen en el vial. Transferencia de volumen del frasco hacia el matraz T75.Nota: Realizar este paso ayuda a maximizar el rendimiento de la célula del frasco. Apriete la tapa del frasco de cultivo de tejidos y muévalo suavemente para dispersar uniformemente células en suspensión a través de toda la superficie. Compruebe la distribución uniforme de las células utilizando un microscopio invertido. Frasco de etiqueta con tipo de celular, fecha, iniciales, linaje y el propósito (por ejemplo, hDFn, 11/07/2018, NDC, pasaje 4, ensayo de Scratch de arsénico). Coloque el frasco de cultivo de tejidos en un incubador humedecido a 37 ° C y 5.0% de CO2 durante 72 h.Nota: Medio de cultivo debe ser cambiado 12-24 h después de la siembra inicial para eliminar trazas de dimetilsulfóxido (DMSO) crioconservante y luego cambia cada 48 h después de eso para asegurar que las células se nutren adecuadamente. El período de incubación y crecimiento dependerá el número calculado de células necesarias para el ensayo de rayado. El tiempo de duplicación de las células de hDFn es típicamente 16-24 h en condiciones normales. Sin embargo, duplicar tasa puede cambiar debido a la elevación, pH, temperatura, humedad, tipo de medio, etc.y deben ser tratadas contablemente al planear experimentos. 3. recuento de células y subcultivo en 12-bien tejido placa de la cultura Recuperar el frasco de cultivo de tejidos T75 de incubadora. Observar células adheridas utilizando un microscopio invertido con 10 aumentos objetivo (total 100 aumentos) y determinar la confluencia celular aproximada. Analizar la mayor parte del frasco de cultivo de tejidos al observar la confluencia para el porcentaje más representativo se aproxima. Evaluar la morfología de la célula individual para cualquier anormalidad, o por contaminación bacteriana o fúngica. Monta la pipeta automática con una pipeta de 10 mL. Utilice la pipeta para aspirar el volumen completo de los medios de comunicación de la solución T75 y transferencia a un contenedor de residuos. Evitar que la punta de la pipeta entre en contacto con la superficie de adhesión de la célula. Deseche la punta de la pipeta en un recipiente de riesgo biológico. Monta la pipeta automática con una pipeta de 5 mL. Aspirar 5 mL de la solución de sal equilibrada, dispensar en el frasco y con cuidado el matraz para enjuagar el exceso de medio, las células muertas y residuos producto. Sacar el volumen de la T75 y echar en el depósito de residuos. Deseche la punta de la pipeta en el recipiente de riesgo biológico. Monta la pipeta automática con un adaptador de pipeta de 5 mL. Aspirar 2 mL de tripsina de la acción, dispensar en el frasco y con cuidado el frasco para dispersar a la enzima en las células adheridas. Asegurar la completa saturación de la superficie adherente. Coloque el frasco de tejido en la incubadora durante 2-3 minutos (min).Nota: La reacción enzima-sustrato máxima no debe exceder 10 minutos. Observar el matraz de tejido bajo un microscopio invertido en una ampliación de objetivo de X 10 (aumento total de X 100). Se aplican suaves vibraciones para facilitar la separación de la célula. Limpie el T75 matraz con alcohol al 70% y lugar dentro de la BSC. Monta la pipeta automática con una pipeta de 5 mL. Aspirar 5 mL de medio de la acción y añadir al matraz de tejido T75 para detener la reacción enzima-sustrato. La relación de los medios de comunicación: tripsina debe ser 3:1. Pipeta de arriba y abajo de la base de la mufla 2 – 3 veces para enjuagar y asegurar que la reacción se detiene. Aspirar el volumen total del líquido del frasco y de transferencia en un tubo cónico de 15 mL estéril. Llenar un segundo tubo cónico de 15 mL con un volumen idéntico de los medios de comunicación. Colocar ambos tubos cónicos de 15 mL en una posición antipodal a uno con el otro. Aplicar 200 g de fuerza centrífuga durante 5 minutos a 25° C mediante el establecimiento de parámetros de funcionamiento del equipo. Limpie el tubo cónico de 15 mL con células pildoradas con alcohol al 70% y colocar dentro de la BSC. Utilizar la pipeta automática con un accesorio de 5 mL para pipeta de medios de comunicación, dejando aproximadamente 250 μl de líquido y células de la pelotilla. Preste atención a la ubicación de la punta de la pipeta, como el precipitado de células debe permanecer inalterado. Distribuir el volumen recogido en un recipiente y descarte la punta en un recipiente de riesgo biológico. Utilizar un bastidor de tubo de microcentrífuga para ejecutar la parte inferior del tubo cónico a través de las ranuras del frasco, creando una vibración rápida, para molestar y Resuspenda el sedimento celular (a veces llamado “estante del rastrillo”).Nota: Evite el uso de un mezclador de tipo vórtex para realizar este paso. Las fuerzas de gravedad creadas por mezcladores vortex superan umbrales de g-force de la célula y pueden causar lisis. Cuando haya completado correctamente, la nueva solución celular aparecerá como una mezcla turbia con ninguna bolita restante. Diligencia que realizar este paso a menudo creará una suspensión unicelular, llevando a mayor precisión cuando el conteo de las células. Añadir 2 mL de medios de comunicación a la población de células o resuspensión. Pipetear las células suavemente hacia abajo del lado del tubo 20 veces para dispersar cualquier grumos. Registrar el volumen de suspensión celular total y dejar de lado brevemente. Pipetee 20 μl del stock de azul de tripán (0.4%) en un pozo vacío de una placa de 96 pozos utilizando una pipeta estéril. Mezcle la solución stock de la célula para generar una suspensión uniforme antes de la transferencia. Utilice una punta de la pipeta estéril para retirar 20 μl del stock de la célula (evitando tocar las paredes del tubo). Añadir a los 20 μl de solución de azul de tripano en la placa de 96 pocillos. Pipetee suavemente para mezclar el contenido. Pipetee 10 μl de la mezcla entre el cubreobjetos y el conteo del compartimiento en el hemocitómetro. Observar las células y la red bajo un objetivo de X 10. Observar nueve cuadrados grandes en el campo de visión. Contar las células sólo en el centro y 4 cuadrados de esquina (total 5 plazas).Nota: Busque una distribución uniforme de las células a través de la red entera para asegurar un conteo preciso. La cuenta de todas las células (transparentes y azul) en las 5 plazas identificadas de la red. Cuenta por separado, sólo las células (azul) no viables en las misma 5 plazas. Calcular la cuenta de célula viable utilizando:donde x = recuento de células viables, un = células totales, b = células no viables Calcular la densidad de células viables usando:donde x = densidad celular viable y y = suma total de células viables. Calcular total células viables:donde x = células viables totales, y = densidad de células viables, f = volumen de suspensión celular (mL). Calcular el % de viabilidad celular:donde x = viabilidad celular por ciento, y = células viables contadas en rejilla, f = células total contadas en la red. Marque una línea horizontal a través de la parte inferior de la placa de 12 pozos para servir como marcas de referencia en la proyección de imagen. Utilizar la densidad de células viables (calculada en 3.3.7) para calcular el volumen de los medios para diluir la acción celular en para sembrar una placa de cultivo de tejidos de 12 pozos.Nota: La célula óptima de siembra la densidad de las células de hDFn es 5.000 células/cm2. Diluya el material celular a 19.000 células/mL utilizando los medios de comunicación y cada pocillo con 1 mL de stock de la célula de la semilla. Mezcla acción célula periódicamente para celular incluso siembra a través de los 12 pozos. Etiqueta de cada placa con el tipo de célula, el linaje, las iniciales del usuario y el propósito. Coloque las placas en la incubadora a 37 ° C y 5.0% CO2. Permitir que las células crecen hasta alcanza 100% de confluencia para ensayo de rayado. 4. arsénico (As) soluciones y cálculos Diluir Sodio arsenito (NaAsO2) directamente en medios de cultivo celular con 10% FBS a concentraciones de trabajo de 10, 1,0, 0,1 y 0,01 μm como. Para esto, hacer un stock inicial de 1 mM como solución diluyendo 3.9 mg de Sodio arsenito en 30 mL de medio. Diluir en serie el stock de 1 mM para el restante como soluciones. 1000 μm como Stock Cálculos Arsénico, concentraciones de bolsa de trabajo M1V1= M2V2 Volumen de la solución anterior de arsénico Volumen de medios de comunicación Volumen total de trabajo valores de arsénico NaAsO2 peso molecular: 129.9 g/mol 10 μm como (x mL) (1.000 μm) = ()(10 µM) 30 mL x = 0.3 mL 0,3 mL = 300 μL de 1mM como solución media de 29,7 mL 30 .03 L x.001 mol/L x 130 g/mol = 3.9 mg de arsénico 1,0 μm como (x mL) (10 μm) = ()(1 µM) 30 mL x = 3 mL 3 mL de 10 μm como solución 27 mL de medios de comunicación 30 Diluir 3,9 mg de arsenito de sodio en medio 30 mL 0,1 μm como (x mL) (1 μm) = ()(0.1 µM) 30 mL x = 3 mL 3 mL de 1 μm como 27 mL de medios de comunicación 30 0,01 μm como (x mL) (0,1 μm) = ()(0.01 µM) 30 mL x = 3 mL 3 mL de 0.1 μm como 27 mL de medios de comunicación 30 Tabla 1. Acciones arsénicas y diluciones seriadas. Esta tabla explican los cálculos utilizados para crear las soluciones stock de As y soluciones para grupos de trabajo. 5. técnica de ensayo y la contaminación por arsénico del rasguño Obtener una placa de 12 pozos con células de la incubadora. Ver las células en una 10 X objetivo magnificación (aumento total de X 100). Determinar confluencia celular en cada pocillo.Nota: Cada bien individual debe alcanzar 100% de confluencia antes de rayar. Este paso crítico asegura la consistencia en el análisis y ayuda a estandarizar los protocolos de análisis a través de experimentos. Si cualquier pozos no han alcanzado el 100% de confluencia, permitir que las células a incubar por un tiempo adicional hasta que todos los pozos han alcanzado 100% de confluencia. No perderá tiempo de crecimiento adicional en los pozos que ya han alcanzado el 100% de confluencia. Células confluentes típicamente se convierten en crecimiento detenido y permanece como una cultura de monocapa, permitiendo el confluentes pozos llegar a 100% de confluencia. Montar una pipeta automática con una pipeta de 10 mL. Aspire el medio de crecimiento de todos los pozos. Desechar el volumen de residuos líquidos y la punta de la pipeta en el recipiente de materiales biológicos peligrosos. Montar una p200 pipeta con una punta estéril 1-200 μl. En cada pozo, producir un arañazo “falsa herida” al deslizar la punta a través de la superficie de la célula de un mediodía a las 6 ubicación.Nota: Los tres factores que afectarán enormemente consistencia son velocidad, presión y ángulo de punta. El cero debe realizarse rápidamente, con una presión constante, mientras que teniendo en cuenta el ángulo de la punta está perpendicular a la base de la placa. Rascarse demasiado lento provocará que las líneas torcidas, exceso de presión puede permanentemente marcar superficies adherentes de la célula y un ángulo de la punta menos de 90° se estrecha la anchura cero. Cualquiera de estos errores comunes puede resultar en tasas de migración alterada y patrones. Limpiar exceso montones de escombros y celular por lavado con 1 mL de solución salina equilibrada por pozo. La placa de lado a lado para facilitar el lavado de la roca. Retire la solución de sal equilibrada de pozos y deseche en un contenedor de residuos. Deseche la punta de la pipeta de 5 mL en el contenedor de materiales biológicos peligrosos. Figura 1: representación esquemática de la prueba de scratch. Todo el trabajo se realiza dentro de un campo aséptico para reducir las probabilidades de contaminación. Las células son sembradas a una densidad deseada en frascos de cultivo de tejidos y cultivadas en una incubadora en condiciones fisiológicas humanas (5% CO2, 37 ° C). Al llegar a una deseada confluencia, las células el asépticamente se cultivan en placas de cultivo de tejidos de 12 pozos a una densidad de siembra deseada. Las células se cultivan hasta confluencia 100% en cada pocillo de la placa de 12 pozos y rayados usando una punta de pipeta estéril. Este “rasguño” crea una en vitro falsa herida (denotada por la flecha doble cabeza), en el cual las células naturalmente migran para cerrar el área abierta. Cada uno bien puede ser únicamente condicionado y tasas de migración celular pueden ser observadas y cuantificadas en respuesta a condiciones de tratamiento diferentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Utilice una pipeta p1000 con una punta de 1.000 μl a 1000 μl de pipeta de las existencias de arsénico en pozos que han sido asignados al azar a un grupo de tratamiento. Utilice una punta de pipeta nueva para cada bien para evitar la contaminación cruzada. Registrar el tiempo cuando se agregan tratamientos. Coloque las placas 12-bien en una incubadora a 37 ° C y 5.0% CO2. 6. proyección de imagen de Capturar imágenes de cada pozo de 10 X objetivo aumento cada 4 h durante 24 h (0, 4, 8, 12, 16, 20 y 24 h). Referencia a la línea previamente dibujada en la parte inferior de la placa de la misma ubicación a lo largo de la raya dentro de cada pozo en momentos posteriores de la imagen.Nota: Es imprescindible que las mismas localizaciones son fotografiados en cada momento para permitir el análisis de una imagen precisa y obtener datos representativos. 7. Análisis de la imagen Subir imágenes en el microscopio de luz invertido a un ordenador y guardar como una imagen JPEG con un nombre de archivo detallado. Abra el ImageJ. Subir una imagen de un micrómetro con distancias conocidas al software para convertir pixeles a milímetros (mm) al tomar las mediciones de imagen arrastrando y soltando el archivo en la ventana del software.Nota: El micrómetro debe tener líneas de demarcación de una longitud conocida de 1 mm y la imagen debe tomarse en el mismo aumento utilizado para capturar imágenes de las células. Por ejemplo, en este estudio se tomaron imágenes a 100 X ampliación total, así la imagen del micrómetro etapa fue tomada en 100 X ampliación total. Haga clic en las opciones rectas, segmentadoo Líneas a mano alzada . Trace una línea de distancia conocida en la imagen del micrómetro mediante el uso de las marcas de graduación largo asociado a cada garrapata marcas. Para dibujar una línea recta: Haz clic en el ratón, mantenga, arrastre el cursor a la posición deseada y soltar del ratón. Seleccione analizar a continuación, seleccione Establecer escala. Establecer Distancia conocida a la conocida longitud de la línea trazada en el paso anterior. Establece la unidad de la longitud en mm. Casilla en el mundial. Seleccione OK para salir del menú. Cerca de la imagen del micrómetro de etapa. Cargar una imagen de ensayo rasguño en ImageJ arrastrando y cayendo archivo de imagen en la ventana. Trazar una línea recta a lo ancho de la raya (desde el borde izquierdo al borde derecho). Pulsa la letra M en el teclado para registrar la medición de la línea recta dibujada. Una pequeña ventana de resultados aparecerá inmediatamente después de escribir la letra M. Esto es donde la medida de ancho. Repita el paso 7.4 un total de 10 veces para obtener 10 medidas a lo largo de la longitud de la raya.Nota: Es importante generar los valores más representativos de ancho abajo toda la longitud de la raya. No se olvide de espaciar las mediciones de 10 ancho igualmente a lo largo del scratch de arriba a abajo. Crear un archivo de hoja de cálculo de ensayo rasguño para copiar y pegar las mediciones. Copiar y pegar las mediciones de 10 ancho de la ventana de resultados en la columna correspondiente en un archivo de hoja de cálculo (tabla 2).Nota: Cuando las mediciones son copiadas de la ventana de resultados y pegar en la hoja de cálculo, habrá extrañas columnas de valores; Estos valores se deben eliminar, conservando sólo las mediciones de 10 ancho. 10 mediciones de anchura al azar 0 h 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Promedio de 10 mediciones Tabla 2. Medidas ancho crudo cuadro formato. Esta tabla muestra la estructura organizacional para las medidas crudas obtenidas. Repita el paso anterior para el resto de las imágenes del ensayo de rayado. Calcule el promedio de las 10 mediciones en cada punto del tiempo (0-24 h) para cada bien. Determinar el por ciento del encierro de cálculos usando los valores de paso 7.8. Crear una tabla en la parte inferior de la hoja de cálculo titulado “promedios de medición de anchura” (tabla 3). Copiar y pegar en que la fila Media de 10 mediciones calcula paso de 7.8 en la tabla “medición de ancho promedio”. Crear otra tabla al lado de la tabla de Promedios de medición de ancho . Título de esta mesa de Cierre de la herida por ciento (cuadro 4).Nota: El valor en la columna h 0 de cada bien debe ser 0 porque el cero es 0% y cerrada en la foto inicial 0 h para todos los pozos. Desplácese a la siguiente columna (4 h). Calcular el cierre por ciento para 4, 8, 12, 16, 20 y puntos de tiempo de 24 h:donde, x = cierre por ciento, i = inicial cero anchura (0 h), f = final scratch anchura (4, 8, 12, 16, 20 o 24 h). Anchura promedio 0 h 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h 1a 2A 3A 4a 1B 2B 3B 4B 1c 2c 3c 4c Tabla 3. Medida de la anchura promedio de formato de tabla. Esta tabla muestra la estructura organizativa para los promedios de medición de anchura calculada usando las medidas de ancho materia prima en la tabla 2. Bien 0 h 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h 1a 0 2A 0 3A 0 4a 0 1B 0 2B 0 3B 0 4B 0 1c 0 2c 0 3c 0 4c 0 Tabla 4. Formato de la tabla de cierre de la herida por ciento. Esta tabla muestra la estructura organizativa para los valores de cierre de herida por ciento calculan utilizando la medida de ancho promedio en la tabla 3. Crear otra tabla junto a la mesa de Cierre de la herida por ciento . Título de esta mesa de AUC (tabla 5). Calcular el 0-4 h área bajo el valor de la curva (AUC) en el 0-4 h columna para cada bien:donde x = 0-4 valor AUC h, a = valor cierre % h 0, b = valor cierre % 4 h, h = el tiempo entre las dos medidas (4 h en este estudio). Calcular el área de 4-8 h en el valor de la curva (AUC) en la columna 4-8 h para cada bien:Donde x = 4-8 h AUC valor, un = valor cierre % 4 h, b = % valor de cierre para 8 h, h = el tiempo entre las dos medidas (4 h en este estudio).Nota: Un valor AUC debe calcularse para cada intervalo de tiempo de 4 h durante el período de 24 h para cada pozo. Suma todos los valores AUC de 0-24 h (calculada en pasos 7.10.1-7.10.2) para obtener un valor AUC sumado para cada pozo. Asegúrese de que estos valores se guardan correctamente para el análisis estadístico. Bien 0-4 h 4-8 h 8-12 h 12-16 h 16-20 h 20-24 h AUC sumada 1a 2A 3A 4a 1B 2B 3B 4B 1c 2c 3c 4c Tabla 5. Formato de la tabla de las AUC. Esta tabla muestra la estructura organizativa para los valores AUC calculan utilizando el porcentaje de valores cierre la herida en la tabla 4. 8. estadístico análisis Determinar el método de análisis estadístico que mejor se adapte al diseño experimental y sumados los valores AUC obtenidos durante el ensayo.