体外皮膚細胞移動へのヒ素の効果を発揮するアッセイをスクラッチします。

1. バイオ II キャビネット (BSC) の準備 注: このプロトコルで説明する方法は、無菌技術を達成するために良い研究所プラクティスを使用している間、個人用保護具と行われなければなりません。 営業の高さに BSC の保護ガラスを持ち上げ、層流ファンをオンに。 70% イソプロパノール水溶液を使用すると、作業領域の衛生ワイプを実行できます。後ろの壁と側壁から BSC をワイプし、ベース プレートまで作業します。 70% アルコール (イソプロパノールまたはエタノール) 試金で使用されるし、BSC 内に配置されるすべての材料を拭いてください。 2 T75 フラスコに播種ひと真皮線維芽細胞 バイアル凍結目的のセル行 (新生児皮膚線維芽細胞 [hDFn] 500,000 セル/バイアル、細胞濃度、通路 p3 ~ p5) を取得します。 解凍できるように 37 ° C で 1.0 cm 深さの水のお風呂に細胞のバイアルを配置します。携帯ソリューションの約 70% が液体になるまでは、バイアルを解凍します。70% アルコールでバイアルを拭く、BSC 内バイアル ラックにバイアルを配置します。注: は、水に接触しないスレッドまたは細胞播種の中に潜在的な汚染を防ぐためにバイアルのキャップを確認します。水の細胞の完全な融解を防ぐお風呂そう失敗が意図しない細胞死を引き起こす可能性があります。 10 mL の培地 10% のうち、ウシ胎児血清 (FBS) を描画します。コート t75 フラスコ培養フラスコに吸引する自動 pipettor と 10 mL のピペット チップを使用します。完全に前後のフラスコを軽くロッキング フラスコのベースを飽和状態にするメディアを許可します。 細胞膜としてピペッティング速度に留意されて、バイアルからセル在庫、吸引ソリューションとオープン ・ バイアル法は凍結から無防備になります。 メディア コート t75 フラスコ培養フラスコにセルを転送します。ピペッティング速度に留意されて再び培養フラスコに解凍セルを取り出します。注: 播種細胞培養フラスコの密度近似 6,600 セル/cm2であること。播種密度は、ユーザーと実験の必要なタイミングに合わせて変更できます。 コート t75 フラスコ培養フラスコからのメディアの 1 つの mL を測定し、バイアルにボリュームを転送します。バイアルから T75 フラスコにボリュームを転送します。注: この手順を実行、バイアルからの細胞収率を最大化するために役立ちます。 組織培養のフラスコのキャップを締め、軽く表面全体に細胞懸濁液中で均一分散する揺り動かし。倒立顕微鏡を用いた細胞の均一な配分をチェックします。 ラベル フラスコ細胞型、日付、イニシャル、系統、および目的 (例えばhDFn、2018/07/11、NDC、通路 4 ヒ素スクラッチ試金)。72 h の 37 ° C および 5.0% の CO2で加湿のインキュベーターで培養フラスコを配置します。注: 培ジメチルスルホキシド (DMSO)、cryopreservative の微量を削除する初期播種後 12-24 時間の変更をする必要があります、セルが正しく栄養を確保するためその後すべての 48 時間を変更します。孵化と成長の期間は、計算されたスクラッチのアッセイに必要な細胞数に依存します。HDFn 細胞の倍加時間は、通常の条件の下で 16-24 時間です。ただし、2 倍率上昇、pH、温度、湿度、メディアの種類等のため変更可能性があり、実験を計画するときに考慮する必要があります。 3. セルを数えると 12 も組織にサブカルチャー文化板 インキュベーターからコート t75 フラスコ培養フラスコを取得します。客観的倍率 10 倍 (100 倍の合計倍率) で倒立顕微鏡を用いた付着細胞を観察し、おおよそセル合流点を決定します。 近似が最も代表的な割合を確保するため合流を観察するときは、組織培養のフラスコの大半をスキャンします。個々 の細胞の形態の異常、細菌や真菌の汚染を評価します。 10 mL のピペット チップで自動 pipettor を組み立てます。廃棄物コンテナーに T75 転送ソリューションからメディアのフルボリュームを吸引するのに pipettor を使用します。ピペット先端部を防ぐ細胞付着表面へのお問い合わせ。バイオハザードのビンにピペット チップを破棄します。 5 mL のピペット チップで自動 pipettor を組み立てます。バランスの取れた塩溶液の 5 mL を吸引、フラスコ、調剤、優しく余分なメディア、死んだ細胞や老廃物を洗浄するフラスコをロックします。 コート t75 フラスコからボリュームを描画し、廃棄容器に分配します。バイオハザード箱にピペット チップを破棄します。 5 mL ピペット アダプターの自動 pipettor を組み立てます。在庫からトリプシンの 2 mL を吸引、フラスコ、調剤および付着細胞に酵素を分散させるためにフラスコを軽くロックします。付着性の表面の完全な飽和を確認します。2-3 分 (分) のためのインキュベーターで培養フラスコの場所。注: 最大酵素-基質反応は 10 分を超えない。 10 倍の対物レンズ倍率 (100 X 合計倍率) で倒立顕微鏡下で培養フラスコを観察します。細胞の剥離を容易にする穏やかな振動を適用します。 70% アルコールと BSC 内 T75 フラスコを拭いてください。 5 mL のピペット チップで自動 pipettor を組み立てます。在庫からメディアの 5 mL を吸引し、酵素反応を停止するコート t75 フラスコ培養フラスコに追加します。メディア: トリプシンの比率は 3:1 にする必要があります。フラスコのベース上下ピペット 2-3 回洗浄し、反応が停止していることを確認します。フラスコと滅菌 15 mL の円錐管に転送からの流体の全集を吸い出しなさい。 メディアの同一のボリュームで 2 番目 15 mL の円錐管を埋めます。 お互いに正反対の位置に両方の 15 mL の円錐管を配置します。25 ° C で 5 分間遠心力の 200 g を機器の実行パラメーターを設定することによって適用されます。 70% アルコールで小球形にされたセルと 15 mL の円錐管をワイプし、BSC 内に配置します。 ピペットで移しなさいメディア、約 250 μ L の液と細胞のペレットを残してオフに 5 mL 添付ファイル付き自動 pipettor を使用します。細胞ペレットを邪魔されずに残るべきである、ピペット先端の位置に注意を払います。廃棄物容器に回収量を調剤し、バイオハザード ビンでヒントを破棄します。 遠心管ラックを使用すると、邪魔し (「速いラック」とも呼ばれる) 細胞ペレットを再停止の迅速な振動を作成するバイアル スロットで円錐管の下部を実行しますします。注意: この手順を実行する渦のミキサーを使用しません。重力渦のミキサーによって作成されたセル g フォースのしきい値を超えるし、溶解を引き起こすことができます。正しく完了すると、新しいセル ソリューションがない残りのペレットと曇りの混合物として表示されます。この手順を実行する勤勉さはしばしば単一細胞懸濁液は、細胞をカウントする場合、精度が向上につながるを作成します。 細胞の在庫または再懸濁に 2 mL の培地を追加します。ピペット 20 チューブの横に優しく細胞回任意の塊を破る。総細胞懸濁液量を記録し、脇に簡潔に。 ピペット 20 μ L のトリパン ブルー在庫 (0.4%)96 ウェル プレートの空井戸に滅菌ピペットを使用します。 転送する前に均一な細胞の懸濁液を生成する在庫の携帯ソリューションをミックスします。滅菌ピペット先端部を使用すると、(管の管壁に触れることを避ける) 細胞の在庫の 20 μ L を削除できます。96 ウェル プレートでトリパン ブルー溶液 20 μ L を加えます。 軽く内容をミックスにピペットで移しなさい。ピペット 10 μ L、coverslip とカウント間の混合物の検定の商工会議所します。 対物レンズ 10 倍下のグリッド セルを観察します。ビューのフィールド内で 9 つの大きな正方形を確認します。中心および 4 角正方形 (5 の正方形の合計) でのみのセルをカウントします。注: は、正確な数を確保するため全体のグリッド上で細胞の均一な分布を探します。 5 識別された正方形グリッドのすべてのセル (透明と青) を集計します。別に、同じ 5 正方形の淘汰 (青) セルだけを集計します。 生菌数を使用して計算します。場所x 生菌数を = = セルの総数が、 b = 非実行可能なセル 生細胞密度を使用して計算します。場所x = 実行可能な細胞密度と y = 実行可能なセルの合計。 生菌数を計算します。場所x生菌数、 yを = = 実行可能な細胞密度、 f = 細胞懸濁液の体積 (mL)。 % 細胞生存率を計算します。場所xパーセント セル実行可能性、 yを = = 実行可能なセル グリッド、 fのカウント = セルの総数がグリッドにカウントします。 イメージ投射の間の参照記号として 12 ウェル プレートの下部に水平方向の行をマークします。 細胞播種 12 ウェル培養プレートの入荷を希釈するメディアの量を計算する (3.3.7 で計算された) 実行可能なセル密度を使用します。注: 播種密度 hDFn セルの最適なセルは 5,000 のセル/cm2です。 19,000 セル/ml に細胞の在庫を希釈メディアを使用し、1 ml の細胞の在庫のすべての井戸をシードします。すべて 12 ウェルの間でシードも携帯できるように定期的にセル在庫をミックスします。 セルの種類、系統、ユーザーの頭文字と目的と各板にラベルを付けます。37 ° C および 5.0% の CO2に設定のインキュベーターでプレートを配置します。スクラッチの試金のため 100% の合流点を達成するまでに成長します。 4. ヒ素 (As) 原液と計算 10% の細胞培養媒体に直接亜ヒ酸ナトリウム (NaAsO2) を希釈 10、1.0、0.1、0.01 μ M としての働く集中で政府短期証券。 このため、メディアの 30 mL に亜ヒ酸ナトリウム 3.9 mg を希釈してソリューションとして初期 1 mM 在庫を確認します。順次残りのソリューションとして 1 mM の在庫を希釈します。 在庫として 1000 μ m計算 作業ストック濃度ヒ素 M1V1= M2V2 以前のヒ素ソリューションのボリューム メディアのボリューム ヒ素通常在庫量 NaAsO2分子の重量: 129.9 g/mol として 10 μ M (mL) x(1,000 μ M) = (30 mL)(10 µM) x = 0.3 mL 解決策として 1 mM の 0.3 mL = 300 μ L 29.7 mL メディア 30 .03 L x.001 mol/L x 130 g/mol = ヒ素の 3.9 mg として 1.0 μ M (mL) x(10 μ M) = (30 mL)(1 µM) x = 3 mL 解決策として 10 μ M の 3 mL メディアの 27 mL 30 30 mL メディアに亜ヒ酸ナトリウム 3.9 mg を希釈します。 として 0.1 μ M (mL) x(1 μ M) = (30 mL)(0.1 µM) x = 3 mL 1 μ m として 3 mL メディアの 27 mL 30 として 0.01 μ M (mL) x(0.1 μ M) = (30 mL)(0.01 µM) x = 3 mL 0.1 μ m として 3 mL メディアの 27 mL 30 テーブル 1。ヒ素株式およびシリアルの希薄。As 溶液と治療群の原液の作業を作成する使用される計算を表します。 5. スクラッチ検定法とヒ素汚染の現状 インキュベーターから細胞 12 ウェル プレートを取得します。対物レンズの倍率 (100 X 合計倍率) × 10 でセルを表示します。各ウェル内のセルの合流を決定します。注: スクラッチ前に 100% の合流点に達する各個々 よくする必要があります。この重要なステップはアッセイ内で整合性が確保され、実験の試金のプロトコルの標準化に役立ちます。どんな井戸 100% 合流点に達していない、すべての井戸が 100% 合流点に到達するまでさらに時間インキュベートする細胞を許可します。既に 100% の合流点に達している井戸でさらなる成長時間を受けません。合流するセル通常逮捕された成長になる、一方で、100% の合流点に到達するサブ合流井戸単層培養として残る。 10 mL のピペット チップで自動 pipettor を組み立てます。すべての井戸のうち成長媒体を吸い出しなさい。液体廃棄物のボリュームと石綿箱にピペット チップを破棄します。 1-200 μ L 滅菌チップ p200 pipettor を組み立てます。各ウェルに、12 時から 6 時の場所に細胞表面の間で先端をグライダーでスクラッチ「モック傷」を生成します。注: が大幅に整合性に影響を与える 3 つの要素は、速度、圧力、および先端角。スクラッチは、プレートのベースに垂直に先端角度を意識しながら一定の圧力で迅速、実行必要があります。遅すぎる傷が原因の曲がった線、過剰な圧力スコアことができます完全に細胞付着面と先端角度 90 ° は傷の幅を狭くよりも少ない。変更された移動率とパターンこれらの共通の間違いの可能性があります。 /ウェル バランスの取れた塩溶液の 1 mL と洗浄によって余分な残骸および細胞塊を取り除きなさい。ロック、プレート サイドにサイド洗浄を容易にします。井戸からバランスの取れた塩溶液を外し、廃棄物容器に廃棄します。石綿箱に 5 mL のピペット チップの処分します。 図 1: スクラッチ アッセイの略図。すべての作業は、汚染の可能性を減らすため、無菌のフィールド内で行われます。細胞培養フラスコで目的の密度でシードされ、人間の生理学的条件 (5% CO2、37 ° C) に設定インキュベーターで栽培します。目的の合流点に達したら、セルは必要な播種密度 12 ウェル培養プレートにサブ培養無菌。セル、12 ウェル プレートと滅菌ピペット先端部を使用して傷の各ウェルに 100% コンフルエントまでに育ちます。この「スクラッチ」は、体外模擬傷 (二重方向の矢印で表されます) 細胞が自然オープン エリア閉じる移行を作成します。それぞれまたすることができますが一意にエアコンと細胞移動率を観察してさまざまな治療条件に応じて定量化します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 使用 p1000 pipettor 1,000 μ L チップ ピペット 1,000 μ L にヒ素を取り揃えておりますから治療群にランダムに割り当てられている井戸に。交差汚染を防ぐために、各ウェルの新しいピペット先端部を使用します。トリートメントを追加するとき時間を記録します。37 ° C および 5.0% の CO2で設定インキュベーターに 12 ウェルのプレートを配置します。 6. 画像 対物レンズの倍率 (0、4、8、12、16、20、および 24 h) 24 時間の期間にわたってすべての 4 h × 10、各ウェルの画像をキャプチャします。以前以降の時点で各ウェル内傷に沿って同じ場所の画像にプレートの底に描かれた線を参照します。注: 正確な画像解析を可能にし、代表的なデータを取得する各時点で同じ場所が撮影されていることが不可欠です。 7. 画像解析 コンピューターを倒立顕微鏡で撮影した画像をアップロードし、詳細なファイル名を持つ JPEG 画像として保存します。 ImageJ を開きます。 ドラッグ アンド ソフトウェアのウィンドウにファイルをドロップして画像測定する際、ミリメートル (mm) にピクセルを変換するソフトウェアに既知の距離とステージ マイクロメータの画像をアップロードします。注: マイクロメータは読み手知られている 1 mm 長さ境界を定めるラインを持つ必要があります、画像はセルの画像をキャプチャするために使用同じ倍率で撮影する必要があります。たとえば、総合倍率 X 100 で撮影を行った本研究でこうしてステージ マイクロメータのイメージで撮影された合計倍率 × 100。 ストレート、分割、またはフリーハンドの線のオプションをクリックします。 各目盛りに関連付けられた長さのティック マークを使用してマイクロメータ イメージ上の既知の距離の線を引くマーク。直線を描画する: マウスをクリックして、押したまま、カーソルを目的の場所にドラッグ、マウスを手放します。 分析スケールを設定を選択します。 前の手順で引かれた線の知られている長さに既知の距離を設定します。 ミリメートルを長さの単位を設定します。 グローバルのボックスを確認します。 メニューを終了する[ok]を選択します。 ステージ マイクロメータ イメージから閉じる。 ImageJ にドラッグ アンド ドロップ イメージ ファイル] ウィンドウに 1 つのスクラッチ アッセイ イメージをアップロードします。 (右のリーディング エッジに左のリーディング エッジ) からスクラッチの幅で直線を描画します。 描画される直線の測定値を記録するキーボードの文字Mを押します。小さな結果ウィンドウは、文字Mを入力した後すぐに表示されます。これは、幅測定がされます。 傷の長さに沿って 10 の測定を取得する 10 回の合計 7.4 の手順を繰り返します。注: 最初の全体の長さを最も具象的な幅の値を生成することが重要です。10 幅測定下に上から傷の長さに沿って等間隔で配置することを確認します。 測定値をコピペ スクラッチ アッセイ スプレッドシート ファイルを作成します。 コピーしてスプレッドシート ファイル (表 2) の適切な列に結果ウィンドウから 10 幅の測定値を貼り付けます。注: 測定結果ウィンドウからコピーし、スプレッドシートに貼り付けるときがあります余分な列の値。これらの値は、10 の幅の測定値のみを保存する、削除されます。 10 のランダム幅の測定値 0 h 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 10 の測定値の平均 表 2。生の幅の測定値は表形式です。生の測定値が得られるための組織構造を示します。 スクラッチ アッセイ イメージの残りの部分について上記の手順を繰り返します。 各時間のポイント (0-24 h) すべての井戸のために 10 の測定値の平均を計算します。 % 閉鎖手順 7.8 から値を使用して計算を決定します。 スプレッドシート」幅測定平均値」のタイトルの下にテーブルを作成する (表 3)。 コピーと貼り付けで計算された平均の 10 測定行「幅の測定値の平均を」テーブルに 7.8 をステップします。 幅測定平均値テーブルの横にある別のテーブルを作成します。これのタイトル表% 創傷閉鎖(表 4)。注: ゼロはすべての井戸の初期 0 h 写真でクローズ 0% 各ウェルの 0 h 列の値は 0 にする必要があります。 (4 h) で次の列に移動します。 4、8、12、16、20、および 24 h タイム ポイントのパーセントの閉鎖を計算します。どこで、x = パーセント閉鎖私初期傷幅 (0 h 幅) = f = 最終的なスクラッチ幅 (4、8、12、16、20、または 24 h)。 井戸幅の平均値します。 0 h 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h 1a 2a 3a 4 a 1b 2b 3b 4b 1 c 2 c 3 c 4 c 表 3。幅の測定値は平均表形式です。この表表 2に元の幅の測定値を使用して計算幅測定平均値の組織構造を示します。 まぁ 0 h 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h 1a 0 2a 0 3a 0 4 a 0 1b 0 2b 0 3b 0 4b 0 1 c 0 2 c 0 3 c 0 4 c 0 表 4。% は創傷閉鎖表形式です。パーセントの創傷閉鎖値計算表 3の平均幅の測定値を使用して組織の構造を示します。 % 創傷閉鎖テーブルの横にある別のテーブルを作成します。これのタイトル表AUC (表 5)。 計算 0-4 0 – 4 曲線 (AUC) 値の下 h エリア各ウェルの h 列。場所x = 0-4 h AUC 値、 0 h、 bの閉鎖率を = = 4 h、 hの閉鎖率 = (この研究で 4 h) の 2 つのメジャーの間の時間。 各ウェルの 4 ~ 8 h 列の曲線 (AUC) 値の下 4-8 h の領域を計算します。場所x = 4-8 h AUC 値、 4 h、 bの閉鎖率を = = 8 h、 hの閉鎖率 = (この研究で 4 h) の 2 つのメジャーの間の時間。注: 1 つの AUC 値は、各ウェルの 24 時間の期間にわたって 4 h の時間間隔ごとに計算する必要があります。 各ウェルの AUC の合計値を取得する (手順 7.10.1-7.10.2 で計算された) 0 24 h から AUC 値のすべてを合計します。これらの値は統計分析のため保存正しくを確認します。 まぁ 0-4 h 4-8 h 8-12 h 12-16 h 16-20 時間 20-24 時間 合計 AUC 1a 2a 3a 4 a 1b 2b 3b 4b 1 c 2 c 3 c 4 c 表 5。AUC の表形式です。AUC 値計算表 4に閉鎖の値を巻き、% を使用して、このテーブルが組織構造を示しています。 8. 統計解析 実験的なデザインと、試験中に得られた合計の AUC 値の両方に最適な統計解析方法を決定します。