In Vitro Scratch test pour démontrer les effets de l’Arsenic sur la Migration cellulaire de la peau

1. Elaboration d’une enceinte de sécurité biologique II (BSC) Remarque : Les méthodes décrites dans le présent protocole devraient être menées avec des équipements de protection individuelle, tout en utilisant les bonnes pratiques de laboratoire pour réaliser une technique aseptique. Lever le verre de protection BSC à hauteur d’utilisation et allumez les ventilateurs d’écoulement laminaire. Solution aqueuse d’isopropanol 70 % permet d’effectuer un effacement de l’assainissement de la zone de travail. Essuyez le BSC depuis le mur du fond et les parois latérales et travailler vers le bas pour la plaque de base. Essuyez tous les matériaux qui seront utilisés dans le test avec 70 % d’alcool (alcool isopropylique ou EtOH) et placez-les à l’intérieur de la BSC. 2. humains fibroblastes dermiques semis dans une fiole de T75 Obtenir des flacons avec la lignée cryoconservés désiré (néonatales fibroblastes dermiques humains [hDFn], à la concentration cellulaire de 500 000 cellules/flacon et au passage p3-p5). Placez une cuvette de cellules dans un bain à 37 ° C pour permettre le dégel 1.0 cm-profondeur. Décongeler le flacon jusqu’à ce qu’environ 70 % de solution cellulaire est liquide. Essuyer la fiole avec de l’alcool 70 % et placer le flacon dans support de flacon à l’intérieur de la BSC.NOTE : S’assurer que l’eau ne vient pas en contact avec des fils ou le bouchon du flacon pour éviter la contamination potentielle au cours de la cellule ensemencement. Éviter la décongélation complète des cellules dans l’eau de bain comme si vous faire peut entraîner la mort cellulaire accidentelle. Tirez 10 mL de milieux supplémentés avec 10 % de sérum fœtal (SVF). Utiliser une pipette automatique et la pointe de pipette de 10 mL pour aspirer T75 flacon de culture de tissus. Permettre aux médias saturer complètement la base de la fiole en poussant doucement le ballon en arrière. Flacon ouvert avec solution stock et aspirer de cellule à partir du flacon, en tenant compte de la vitesse de pipetage, comme les membranes cellulaires seront vulnérable de cryoconservation. Cellules de transfert dans une fiole de tissu T75 avec les médias. Éjecter cellule décongelé dans ballon de tissu, à nouveau en tenant compte de la vitesse de pipetage.NOTE : Ensemencement de densité des cellules en fiole de tissu est approchée pour être 6 600 cellules/cm2. Densité de semis peuvent être modifié pour tenir compte de l’utilisateur et le temps souhaité de l’expérimentation. Prélever 1 mL de médias de fiole de tissu T75 et transfert de volume dans le flacon. Transfert de volume du flacon dans la fiole T75.Remarque : Cette étape permet de maximiser le rendement de la cellule à partir du flacon. Serrer le bouchon de flacon de culture de tissus et balancer doucement pour disperser uniformément les cellules en suspension sur toute la surface. Vous recherchez une distribution uniforme des cellules à l’aide d’un microscope inversé. Fiole d’étiquette avec cellules type, date, initiales, lignée et le but (p. ex., hDFn, 11/07/2018, NDC, Passage 4, Arsenic Scratch Assay). Place flacon de culture de tissus dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5,0 % de CO2 pendant 72 h.Remarque : Milieu de croissance devrait être changé 12 à 24 heures après l’ensemencement initial pour enlever les traces de diméthylsulfoxyde (DMSO) cryoconservation et ensuite changé toutes les 48 h après cela pour s’assurer que les cellules sont correctement nourris. La période d’incubation et de la croissance dépendra le nombre de cellules nécessaires pour le dosage de gratter. Le temps de doublement des cellules hDFn est généralement de 16 à 24 heures dans des conditions normales. Cependant, doublement taux peut varier en élévation, pH, température, humidité, type de média, etc.et doit être pris en compte lors de la planification des expériences. 3. comptage de cellules et de sous-culture dans les tissus de 12 puits Culture plaque Récupérer la fiole de vitroplants T75 d’incubateur. Observer des cellules adhérentes à l’aide d’un microscope inversé à objectifs grossissement de 10 X (grossissement total de 100 X) et déterminer la confluence cellulaire approximative. Analyse la majorité de la fiole de vitroplants lorsque observant confluence pour assurer le pourcentage plus représentatif est approximée. Évaluer la morphologie des cellules individuelles pour toute anomalie ou contamination bactérienne ou fongique. Assembler la pipette automatique avec une pointe de pipette 10 mL. Pipette permet d’aspirer tout le volume du média par la solution T75 et le transfert à un conteneur à déchets. Empêcher l’embout de la pipette de toucher la surface des cellules adhérentes. Jeter l’embout de la pipette dans un bac de biohazard. Assembler la pipette automatique avec une pointe de pipette de 5 mL. Aspirer 5 mL de la solution saline équilibrée, verser dans la fiole et balancer doucement le flacon pour rincer l’excès médiatique, les cellules mortes et produit des déchets. Tirer le volume de la T75 et verser dans le récipient à déchets. Jeter l’embout de la pipette dans le bac de biohazard. Assembler la pipette automatique avec un adaptateur de pipette de 5 mL. Aspirer 2 mL de trypsine du stock, verser dans la fiole et balancer doucement le flacon pour disperser l’enzyme dans les cellules adhérentes. Assurer la saturation complète de la surface d’adhérence. Placer le ballon de tissu dans l’incubateur pendant 2-3 minutes (min).Remarque : La réaction de l’enzyme / substrate maximale ne doit pas dépasser 10 min. Observer la fiole de tissu sous un microscope inversé à un grossissement de porte-objectif 10 X (grossissement total de X 100). Appliquer les douces vibrations afin de faciliter le détachement de la cellule. Essuyer la fiole T75 avec 70 % d’alcool et de la place à l’intérieur de la BSC. Assembler la pipette automatique avec une pointe de pipette de 5 mL. Aspirer 5 mL de médias du stock et ajouter dans le ballon de tissu T75 pour arrêter la réaction enzyme / substrate. Le rapport de médias : trypsine doit être de 3:1. Pipette de haut en bas de la base de la fiole 2 ou 3 fois pour rincer et faire en sorte que la réaction est arrêté. Aspirer le volume complet du liquide de la fiole et transvaser dans un tube conique stérile de 15 mL. Remplir un deuxième tube conique de 15 mL avec un volume identique de médias. Placer les deux tubes coniques 15 mL dans une position aux antipodes les uns. S’applique à 200 g de la force centrifuge pendant 5 min à 25° C en définissant des paramètres de fonctionnement de l’équipement. Essuyer le tube conique de 15 mL avec cellules granulés contenant 70 % d’alcool et le placer à l’intérieur de la BSC. Utilisez la pipette automatique avec un attachement de 5 mL à la pipette hors médias, laissant derrière eux quelque 250 µL d’extrait concentré liquide et de cellules. Faites attention à l’emplacement de l’embout de la pipette, car le culot cellulaire doit rester immobile. Doser le volume recueilli dans un conteneur à déchets et jeter le bout dans un bac de biohazard. Un support de tubes de microcentrifuge permet d’exécuter la partie inférieure du tube conique à travers les fentes de flacon, créant une vibration rapide, pour perturber et remettre en suspension le culot cellulaire (parfois appelé « ratisser des grilles »).Remarque : Évitez d’utiliser un mélangeur vortex pour effectuer cette étape. Les forces de gravité créées par mélangeurs vortex dépassent les seuils de cellule g-force et peuvent provoquer la lyse. Une fois rempli correctement, la nouvelle solution de cellule apparaîtra comme un mélange nuageux avec aucune granule restant. Diligence raisonnable cette étape créera souvent une suspension monocellulaire, conduisant à une plus grande précision lors du comptage des cellules. Ajouter 2 mL de médias à la remise en suspension ou des souches de cellules. Pipette les cellules doucement vers le bas de la paroi du tube 20 fois pour briser les mottes. Noter le volume de suspension cellulaire totale et mettre de côté brièvement. Pipeter 20 µL de stock bleu Trypan (0,4 %) dans un puits d’une plaque 96 puits à l’aide d’une pipette stérile de vide. Mélanger la solution stock cellulaire pour générer une suspension cellulaire uniforme avant le transfert. Utiliser un embout de la pipette stérile pour enlever 20 µL du stock de cellule (en évitant le contact avec les parois du tube). Ajouter à la 20 µL de solution de bleu de Trypan dans la plaque à 96 puits. Pipette doucement pour mélanger le contenu. Déposer 10 µL du mélange entre la lamelle et le dépouillement de chambre sur le hémocytomètre. Observer les cellules et la grille sous un objectif 10 X. Observer les neuf grandes places dans le champ de vision. Compter les cellules que dans le centre et 4 places d’angle (5 places au total).Remarque : Recherchez une distribution uniforme des cellules à travers l’ensemble du réseau afin d’assurer un décompte précis. Toutes les cellules (transparents et bleus) sur les 5 places identifiées de la grille de pointage. Séparément, tally uniquement les cellules non viables (bleus) dans les mêmes 5 carrés. Calculer à l’aide de la numération de cellules viables :où x = nombre de cellules viables, un = cellules totales, b = cellules non viables Calculer la densité de cellules viables à l’aide :où x = densité des cellules viables et y = la somme totale des cellules viables. Calculer le totales cellules viables :où x = totales cellules viables, y = densité des cellules viables, f = volume de suspension cellulaire (mL). Calculer la viabilité cellulaire % :où x = la viabilité des cellules pour cent, y = cellules viables dénombrées sur grille, f = cellules totales comptées sur la grille. Tracer une ligne horizontale traversant la partie inférieure de la plaque de 12 puits pour servir de repères en imagerie. La densité de cellules viables (calculée en 3.3.7) permet de calculer le volume des médias afin de diluer le stock cellulaire pour les semis d’une plaque de culture de tissu de 12 puits.Remarque : La cellule optimale semis à densité de cellules hDFn est 5 000 cellules/cm2. Diluer le stock de cellules à 19 000 cellules/mL à l’aide des médias et chaque cupule avec 1 mL de stock de cellules des graines. Mélanger le stock de cellules périodiquement pour assurer la même cellule ensemencement à travers tous les 12 puits. Étiquetez chaque assiette avec le type de cellule, la lignée, les initiales de l’utilisateur et le but. Placer les plaques dans l’incubateur fixé à 37 ° C et 5,0 % de CO2. Permettre aux cellules de croître jusqu’à atteindre 100 % confluence pour dosage zéro. 4. l’arsenic (As) Solutions mères et calculs Diluer l’Arsénite de sodium (NaAsO2) directement dans les milieux de culture cellulaire avec 10 % FBS à des concentrations de 10, 1.0, 0,1 et 0,01 µM comme travail. Pour cela, faire un stock initial de 1 mM comme solution de dilution 3,9 mg d’Arsénite de sodium dans 30 mL de médias. En série, diluer le stock de 1 mM pour les autres solutions. 1000 µM en Stock Calculs Arsenic Concentrations Stock de travail M1V1= M2V2 Volume de la Solution précédente de l’Arsenic Volume des médias Volume total d’Arsenic, Stock de travail Poids moléculaire de NaAsO2 : 129,9 g/mol 10 µM comme (x mL) (1 000 µM) = ()(10 µM) 30 mL x = 0,3 mL 0,3 mL = 300 µL de 1mM comme solution médias de 29,7 mL 30 .03 L x.001 mol/L x 130 g/mol = 3,9 mg d’Arsenic 1,0 µM comme (x mL) (10 µM) = ()(1 µM) 30 mL x = 3 mL 3 mL de 10 µM comme solution 27 mL de médias 30 Diluer 3,9 mg d’Arsénite de sodium dans 30 mL de milieu 0,1 µM comme (x mL) (1 µM) = ()(0.1 µM) 30 mL x = 3 mL 3 mL de 1µm comme 27 mL de médias 30 0,01 µM comme (x mL) (0,1 µM) = ()(0.01 µM) 30 mL x = 3 mL 3 mL de 0,1 µM comme 27 mL de médias 30 Tableau 1. Stocks de l’arsenic et les dilutions en série. Ce tableau explique les calculs utilisés pour créer les solutions mères As et solutions courantes pour groupes de travail. 5. si vous grattez la Technique de dosage et de la contamination par l’Arsenic Obtenir une plaque de 12 puits avec des cellules de l’incubateur. Découvre des cellules à un 10 X grossissement objectif (grossissement total de X 100). Déterminer le confluent de la cellule au sein de chaque puits.Remarque : Chaque puits individuels doivent atteindre 100 % confluence avant de gratter. Cette étape critique assure la cohérence dans l’analyse et permet d’uniformiser les dosage à travers des expériences. Si aucun puits n’ont pas atteint 100 % confluence, laisser incuber pendant un délai supplémentaire jusqu’à ce que tous les puits ont atteint 100 % confluence des cellules. Ne souffrira pas temps de croissance supplémentaire dans les puits qui ont déjà atteint le confluent de 100 %. Confluentes généralement deviendra la croissance arrêtée et restent comme une culture monocouche, tout en permettant aux puits Sub confluentes atteindre 100 % confluence. Assembler un pipetteur automatique avec une pointe de pipette 10 mL. Aspirer les milieux de croissance hors de tous les puits. Disposer le volume de déchets liquides et l’embout de la pipette dans le bac de risques biologiques. Assembler une multipipette p200 avec une pointe stérile de 1-200 µL. Dans chaque puits, produire une égratignure « blessure simulée » en glissant la pointe sur la surface des cellules à un 12-heures à 6 heures-Emplacement.Remarque : Les trois facteurs qui affecteront grandement la cohérence sont vitesse, pression et l’angle de pointe. Le zéro doit être effectué rapidement, avec une pression constante, tout en étant conscient de l’angle de pointe rester perpendiculaire à la base de la plaque. Se gratter trop lentement entraînera lignes bleues en surpression peut définitivement marquer les surfaces adhérentes de cellules et un angle de pointe inférieure à 90° réduira la largeur de la rayure. Une de ces erreurs courantes peuvent entraîner les taux de migration altérée et les modèles. Nettoient les amas de débris et cellule excédentaires en rinçant avec 1 mL d’une solution saline équilibrée par puits. Roche la plaque à côté pour faciliter le lavage. Enlever la solution saline équilibrée de puits et jeter dans un conteneur à déchets. Jeter la pipette 5 mL dans le bac de risques biologiques. Figure 1 : représentation schématique de l’essai gratter. Tout le travail est effectué dans un champ aseptique pour diminuer les risques de contamination. Cellules sont ensemencées à la densité voulue dans des flacons de culture de tissus et cultivés dans un incubateur, la valeur des conditions physiologiques humaines (5 % de CO2, 37 ° C). En arrivant à un confluent désiré, cellules sont cultivées aseptiquement Sub en plaques de culture de tissu de 12 puits à une densité de semis désirée. Cellules sont cultivées à la confluence de 100 % dans chaque puits de la plaque de 12 puits et rayé à l’aide d’un embout stérile. Cette « scratch » crée une in vitro simulacre plaie (dénotée par la double flèche vers la tête), dans lequel les cellules migrent naturellement pour fermer l’aire ouverte. Chaque bien peut être particulièrement bien conditionné et les taux de migration cellulaire peuvent être observées et quantifiées en réponse à des conditions différentes de traitement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Utiliser une pipette à p1000 avec une pointe de 1 000 µL à distribuer 1 000 µL provenant des stocks d’arsenic dans les puits qui ont été assignés au hasard à un groupe de traitement. Utiliser un nouvel embout de la pipette pour chaque puits pour éviter toute contamination croisée. Enregistrer l’heure où les traitements sont ajoutés. Placez les plaques de 12 puits dans un incubateur à 37 ° C et 5,0 % de CO2. 6. l’imagerie Capturer des images de chaque puits à 10 X grossissement objectif toutes les 4 h sur une période de 24h (0, 4, 8, 12, 16, 20 et 24 h). Faire référence à la ligne tracée précédemment sur la partie inférieure de la plaque d’image au même endroit le long de la rayure au sein de chaque puits aux périodes ultérieures.Remarque : Il est impératif que les mêmes endroits sont photographiés à chaque point dans le temps permettant l’analyse des images précises et d’obtenir des données représentatives. 7. image Analysis Télécharger des images capturées sur le microscope inversé léger à un ordinateur et l’enregistrer sous forme d’image JPEG avec un nom de fichier détaillé. Ouvrez ImageJ. Télécharger l’image d’un micromètre avec distances connues sur le logiciel pour convertir pixel en millimètres (mm) lors de la prise de mesures de l’image en faisant glisser le fichier dans la fenêtre du logiciel.Remarque : Le micromètre devrait avoir des lignes délimitant une longueur connue de 1 mm et l’image doit être prise au même grossissement utilisé pour capturer des images de cellules. Par exemple, dans cette étude des images ont été prises à 100 X de grossissement total, donc l’image du micromètre a été amenée à 100 X de grossissement total. Cliquez sur les options de droite, sectorielleou Des lignes à main levée . Tracer une ligne de distance connue sur l’image du micromètre en utilisant les graduations d’une longueur associée à chaque tick marks. Dessiner une ligne droite : cliquez sur la souris, maintenez, faites glisser le curseur à l’emplacement souhaité, puis relâchez la souris. Sélectionnez analyser puis sélectionnez Échelle à définir. La valeur Distance connue la longueur connue de la ligne tracée à l’étape précédente. A unité de longueur en mm. Cochez la case globale. Cliquez sur OK pour quitter le menu. Conclusion de l’image de micromètre de scène. Uploader une image de dosage zéro dans ImageJ par glisser-déposer fichier d’image dans la fenêtre. Dessiner une ligne droite sur toute la largeur de la rayure (du bord gauche au bord droit). Appuyez sur la lettre M sur le clavier pour enregistrer la mesure de la ligne droite tracée. Une petite fenêtre de résultats s’affiche immédiatement après avoir tapé la lettre M. C’est où sera la mesure de la largeur. Répétez l’étape 7.4 un total de 10 fois pour obtenir 10 mesures le long de la rayure.Remarque : Il est important de générer les valeurs de largeur plus représentative sur toute la longueur de la rayure. Veillez à espacer les mesures de 10 largeur également le long de la rayure de haut en bas. Créez un fichier de feuille de calcul de dosage zéro pour copier et coller les mesures. Copiez et collez les mesures 10 largeur de la fenêtre de résultats dans la colonne appropriée dans un fichier de feuille de calcul (tableau 2).Remarque : Lorsque les mesures sont copiés à partir de la fenêtre de résultats et collés dans la feuille de calcul, il y aura des colonnes superflues des valeurs ; ces valeurs devraient être supprimés, conservant seulement les mesures de 10 largeur. 10 mesures de largeur au hasard 0 h 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24h 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Moyenne de 10 mesures Le tableau 2. Mesures de largeur brute tableau format. Ce tableau montre la structure organisationnelle pour les mesures brutes obtenues. Répéter l’étape ci-dessus pour le reste des images dosage zéro. Calculer la moyenne des 10 mesures à chaque instant (0-24 h) pour chaque cupule. Déterminer le % de fermeture des calculs en utilisant les valeurs de l’étape 7,8. Créer une table en bas de la feuille de calcul intitulée « largeur mesure moyennes » (tableau 3). Copiez et collez en que la ligne Moyenne de 10 mesures calculée étape 7,8 dans le tableau « mesure de la largeur en moyenne ». Créer une autre table à côté de la table Largeur mesure moyennes . Titre de ce tableau Fermeture de plaie pour cent (tableau 4).Remarque : La valeur dans la colonne 0 h pour chaque puits doit être 0 parce que le scratch est de 0 % à la photo initiale h 0 pour tous les puits. Accédez à la colonne suivante au-dessus (4 h). Calculer la pourcentage fermeture pour 4, 8, 12, 16, 20 et points de temps de 24h :où, x = pourcentage fermeture, j’ai = largeur initiale de gratter (largeur 0 h), f = finale scratch largeur (4, 8, 12, 16, 20 ou 24 h). Moyenne de la largeur du puits 0 h 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24h 1 a 2 a 3 a 4 a 1 b 2 b 3 b 4 b 1c 2c 3C 4C Tableau 3. Mesure de la largeur moyenne de format de tableau. Ce tableau montre la structure organisationnelle pour les moyennes de mesure largeur calculée d’après les mesures de largeur brute dans le tableau 2. Eh bien 0 h 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24h 1 a 0 2 a 0 3 a 0 4 a 0 1 b 0 2 b 0 3 b 0 4 b 0 1c 0 2c 0 3C 0 4C 0 Tableau 4. Pour cent plaies format de table de fermeture. Ce tableau montre la structure organisationnelle pour les valeurs de fermeture de plaie pourcentage calculé à l’aide de la mesure de la largeur moyenne au tableau 3. Créer une autre table à côté de la table Fermeture de plaie pour cent . Titre de ce tableau AUC (tableau 5). Calculer le 0-4 h zone inférieur à la valeur de la courbe (AUC) dans le 0-4 h colonne pour chaque puits :où x = 0-4 h valeur AUC, a = % valeur de fermeture pour 0 h, b = % valeur de fermeture pendant 4 h, h = le temps entre les deux mesures (4 h dans cette étude). Calculer l’aire de 4 à 8 heures inférieur à la valeur de la courbe (AUC) dans la colonne de 4 à 8 heures pour chaque puits :Où x = 4-8 h AUC value, un = % valeur de fermeture pendant 4 h, b = % valeur de fermeture pendant 8 h, h = le temps entre les deux mesures (4 h dans cette étude).NOTE : Une valeur AUC doit être calculée pour chaque intervalle de temps de 4 h sur la période de 24 heures pour chaque puits. Somme de toutes les valeurs de l’AUC 0-24 h (calculé en étapes 7.10.1-7.10.2) pour obtenir une valeur totale de AUC pour chaque puits. S’assurer que ces valeurs sont correctement enregistrées pour l’analyse statistique. Eh bien 0-4 h 4-8 h 8-12 h 12-16 h 16-20 h 20-24 h AUC somme 1 a 2 a 3 a 4 a 1 b 2 b 3 b 4 b 1c 2c 3C 4C Tableau 5. Format de table des AUC. Ce tableau montre la structure organisationnelle pour les valeurs de l’AUC calculés en utilisant le pourcentage enroulé valeurs de fermeture dans le tableau 4. 8. analyse statistique Déterminer la méthode d’analyse statistique qui correspond le mieux aux somme AUC valeurs obtenues au cours de l’essai et expérimental.