В пробирке Поцарапать Assay для демонстрации воздействия мышьяка на миграции клеток кожи

1. Подготовка кабинета II биобезопасности (BSC) Примечание: Методы, описанные в настоящем протоколе должна проводиться с индивидуальной защиты, при использовании надлежащей лабораторной практики для достижения асептической техники. Снять защитное стекло BSC для эксплуатации высоту и включите ламинарным потоком болельщиков. Используйте изопропиловый спирт 70% водный раствор для очистки канализации рабочей области. Протрите BSC от задней стенки и боковые стены и работать вниз основание. Уничтожить все материалы, которые будут использоваться в assay с 70% спирта (изопропиловый спирт или EtOH) и поместите их в BSC. 2. дермальный фибробластов посева в колбе T75 Получите флаконов с желаемой криоконсервированных клеток линии (неонатальной дермального фибробластов [hDFn], концентрация клеток 500000 клеток/флакон и проход p3-p5). Поместите ампулу с ячейками в 1.0-cm глубокий водяной бане при 37 ° C, чтобы позволить оттаивания. Оттепель флакона до примерно 70% клеток раствор жидкости. Протрите флакон с 70% спирта и место флакон флакон стойку внутри BSC.Примечание: Убедитесь, что вода не вступают в контакт с потоки или колпачок флакона для предотвращения возможного загрязнения во время заполнения ячейки. Предотвратить полное размораживание клеток в воде ванны как неспособность сделать это может привести к непреднамеренному клеточной смерти. Вытянуть 10 мл средства массовой информации дополнена 10% плода Bovine сыворотки (ФБС). Использование автоматических дозаторов и кончиком пипетки 10 мл для аспирационная в колбу T75 культуры ткани. Разрешить СМИ полностью насытить базы колбы, осторожно тряся колбу взад и вперед. Открытый флакон с сотовый фондовой и аспирата решение от флакона, вспоминая дозирования скорости, как будет уязвимой от криоконсервирования клеточных мембран. Клетки перехода к T75 ткани колбу со средствами массовой информации. Извлечь талой клеток в колбу ткани, снова Вспоминая дозирования скорости.Примечание: Заполнение плотность клеток в тканях колбу приближена к быть 6600 клеток/см2. Плотность посева могут быть изменены для размещения пользователей и желаемого времени экспериментов. Отмерьте 1 мл СМИ от T75 ткани колбу и объем трафика обратно в пробирку. Объем трафика из флакона обратно в колбу T75.Примечание: Выполняя этот шаг помогает максимизировать урожайность клеток из флакона. Завинтите крышку колбу культуры ткани и осторожно покачайте разойтись клеток в суспензии равномерно по всей поверхности. Проверка для равномерного распределения клеток с помощью инвертированного микроскопа. Метки колбы с типом ячейки, Дата, инициалы, происхождение и цель (например, hDFn, 07/11/2018, пробирного поцарапать НДЦ, 4 прохода, мышьяк). Место культуры ткани колбу в увлажненные инкубатора при 37 ° C и 5,0% CO2 за 72 ч.Примечание: Среднего роста должны быть изменены 12-24 ч после первоначального заполнения для удаления следов диметилсульфоксида (ДМСО) cryopreservative, а затем изменили каждые 48 ч после этого, чтобы убедиться, что клетки правильно питаться. Период инкубации и рост будет зависеть расчетное количество клеток, необходимых для пополнения assay. Удвоение время hDFn клетки обычно является 16-24 ч при нормальных условиях. Однако, удвоение ставки могут меняться из-за высоты, рН, температуры, влажности, типа носителя и т.д.и должны быть учтены при планировании экспериментов. 3. сотовый подсчета и субкультуры 12-ну ткани культура пластины Извлечь T75 культуры ткани настой из инкубатора. Соблюдать придерживался клетки с помощью инвертированного микроскопа в цель увеличение 10 X (100 X общее увеличение) и определить приблизительное ячейки слияния. Сканировать большинство колбу культуры ткани, когда наблюдения слияния для обеспечения наиболее представительных процент приближена. Оцените отдельные ячейки морфологии для каких-либо отклонений или бактериального и грибкового заражения. Монтаж автоматических дозаторов с кончиком пипетки 10 мл. Используйте дозаторов для аспирационная полный объем СМИ от T75 и передачи решения в контейнер для отходов. Предотвратить связаться присоединения поверхности клетки наконечник пипетки. Утилизируйте наконечник пипетки в биологической Бен. Монтаж автоматических дозаторов с кончиком пипетки 5 мл. Аспирационная 5 мл сбалансированного солевого раствора, обойтись в колбу и встряхните флакон для полоскания избыток средств массовой информации, мертвые клетки и отходы. Нарисовать тома из T75 и обойтись в контейнер для отходов. Утилизируйте наконечник пипетки в биологической Бен. Монтаж автоматических дозаторов с адаптером Пипетка 5 мл. Аспирационная 2 мл трипсина из запасов, обойтись в колбу и встряхните флакон для разгона фермента над придерживался клетки. Обеспечить полное насыщение адэрентных поверхности. Место ткани колбу в инкубаторе для 2-3 минуты (мин).Примечание: Максимальная фермента субстрата реакции не должен превышать 10 мин. Наблюдать за колбу ткани под инвертированным микроскопом на 10 крат объектива (100 X общее увеличение). Примените нежной вибрации для облегчения мобильный отряд. Протрите T75 колбу с 70% спирта и место внутри BSC. Монтаж автоматических дозаторов с кончиком пипетки 5 мл. Аспирационная 5 мл СМИ из запасов и добавить в настой ткани T75 остановить фермента субстрата реакции. СМИ: трипсина соотношение должно быть 3:1. Накапайте вверх и вниз база фляга 2 – 3 раза для полоскания и убедитесь, что реакция остановилась. Аспирационная полный объем жидкости из фляги и передачи в стерильных 15 мл конические. Заполните второй 15 мл Конические трубки с идентичными объем средств массовой информации. Место оба 15 мл конические трубы в противоположную позицию друг к другу. Применить 200 g центробежной силы 5 минут при температуре 25° C, задав параметры работы оборудования. Протрите 15 мл Конические трубки с гранулированных клетки с 70% спирта и место внутри BSC. Использование автоматических дозаторов с 5 мл привязанность к накапайте от СМИ, оставив примерно 250 мкл жидкости и клетки Пелле. Обратите внимание на расположение кончика пипетки, как гранулы ячейки должны оставаться нетронутыми. Распределить объем собранных в контейнер для отходов и отменить отзыв в биологической Бен. Для запуска в нижней части Конические трубки во флаконе слотов, создавая быстрые вибрации, беспокоить и вновь приостановить ячейки Пелле (иногда называемый «стеллаж сгребать») используйте стойку пробки microcentrifuge.Примечание: Избегайте вихревой смеситель для выполнения этого шага. Силы тяжести созданные вихревой Смесители превышают пороговые значения ячейки g-force и может вызвать лизировать. Когда завершена правильно, новое решение ячейки будет отображаться как облачно смесь не оставшихся тампоном. Зачастую осмотрительности, выполняя этот шаг создаст одну ячейку подвеска, приводит к повышенной точности при подсчете клетки. Добавьте 2 мл средства массовой информации в ячейки акции или ресуспендирования. Накапайте клетки мягко вниз стороне трубки 20 раз разрушить любые сгустки. Запишите объем общей ячейки подвеска и отложите в сторону кратко. Накапайте 20 мкл Трипановый синий запасов (0.4%) в пустой колодец 96-луночных пластину, используя стерильные пипетки. Mix решение акций ячейки для создания единой клетки подвеска перед передачей. Используйте стерильные пипетки подсказка для удаления 20 мкл ячейку запасов (избегая касаясь стены трубы). Добавьте 20 мкл раствора Трипановый синий в 96-луночных пластины. Накапайте осторожно, чтобы смешать содержимое. Накапайте 10 мкл смеси между coverslip и подсчета камеры на Горяева. Наблюдать за клетки и сетку под объектив 10 X. Наблюдать за девять больших площадей в поле зрения. Подсчитать ячейки только в центре и 4 угол клетки (всего 5 квадратов).Примечание: Посмотрите на равномерное распределение клеток через всю сетку, чтобы обеспечить точный подсчет. Подсчитайте все клетки (прозрачный и синий) в 5 выявленных квадратов сетки. Отдельно Талли только нежизнеспособных (синий) клетки в том же 5 квадратов. Вычислите с помощью количество жизнеспособных клеток:где x = количество жизнеспособных клеток, = общая клетки, b = нежизнеспособных клеток Вычислите плотность жизнеспособных клеток с помощью:где x = плотность жизнеспособных клеток и y = общая сумма жизнеспособных клеток. Вычислите общее жизнеспособных клеток:где x = общая жизнеспособных клеток, y = плотность жизнеспособных клеток, f = объем ячейки подвеска (мл). Вычислите % жизнеспособность клеток:где x = жизнеспособности процент клеток, y = жизнеспособных клеток, рассчитывали на сетке, f = общая клетки, рассчитывали на сетке. Марк горизонтальную линию в нижней части пластины 12-Ну в качестве опознавательных знаков во время визуализации. Используйте плотность жизнеспособных клеток (рассчитывается в 3.3.7) для вычисления объема СМИ разбавлять клеток складе для посева культуры ткани 12-ну пластины.Примечание: Оптимальное ячейки посева плотности для hDFn клеток является 5000 клеток/см2. Разбавить ячейку запасов до 19000 клеток/мл с помощью средств массовой информации и семян каждый хорошо с 1 мл бульона клеток. Смешайте клеток фондовых периодически для обеспечения даже клетки посева во всех 12 скважин. Этикетке каждой пластины с типом ячейки, lineage, инициалы пользователя и цели. Поместите пластины в инкубаторе, равным 37 ° C и 5,0% CO2. Позволяют клеткам расти вплоть до слияния 100% для нуля assay. 4. мышьяка (As) акций решений и расчетов Разбавить арсенита натрия (NaAsO2) непосредственно в ячейку культуры СМИ с 10% FBS в рабочих концентрациях и 10, 1.0, 0,1, 0,01 мкм как. Для этого сделать первоначальный 1 приклад как решение путем разбавления 3,9 мг арсенита натрия в 30 мл средств массовой информации. Серийно развести 1 приклад для остальных как решения. 1000 мкм как запас Расчеты Рабочая штока концентрации мышьяка M1V1=2V M2 Объем раствора предыдущих мышьяка Объем средств массовой информации Общий объем работы фондового мышьяка NaAsO2 молекулярный вес: 129.9 г/моль 10 мкм, как (x mL) (1000 мкм) = (30 мл)(10 µM) x = 0,3 мл 0,3 мл = 300 мкл 1 мм как решение 29,7 мл СМИ 30 .03 L х.001 моль/Л x 130 г/моль = 3,9 мг мышьяка Как 1.0 мкм (x mL) (10 мкм) = (30 мл)(1 µM) x = 3 мл 3 мл 10 мкм, как решение 27 мл средства массовой информации 30 Разбавить 3,9 мг арсенита натрия в 30 мл средства массовой информации 0,1 мкм, как (x mL) (1 мкм) = (30 мл)(0.1 µM) x = 3 мл 3 мл 1 мкм, как 27 мл средства массовой информации 30 0,01 мкм как (x mL) (0,1 мкм) = (30 мл)(0.01 µM) x = 3 мл 3 мл 0,1 мкм, как 27 мл средства массовой информации 30 Таблицы 1. Мышьяк запасов и серийных разведений. Эта таблица объясняет расчеты, используемые для создания запасов решения As и рабочие запасов решения для лечения групп. 5. царапинам Assay технику и мышьяком Получите 12-ну тарелку с ячейками из инкубатора. Просмотр клетки в 10 кратном объективных (100 X общее увеличение). Определите слияния клеток в каждой скважине.Примечание: Каждый индивидуальный хорошо, должны достичь 100% слияния до царапин. Этот критический шаг обеспечивает согласованность в рамках анализа и позволяет унифицировать assay через эксперименты. Если любой скважин не достигли 100% слияния, позволяют клеткам Инкубируйте дополнительное время до тех пор, пока все скважины достигли 100% слияния. Дополнительные роста времени в скважинах, которые уже достигли 100% слияния не будут затронуты. Вырожденная клетки обычно станет роста арестован и остаются монослойном культивировании, позволяя югу вырожденная скважин для достижения 100% слияния. Монтаж автоматических дозаторов с кончиком пипетки 10 мл. Аспирационная роста СМИ из всех скважин. Распоряжаться объема жидких отходов и кончиком пипетки в бин биологической опасности. Соберите Р200 дозаторов с 1-200 мкл стерильные наконечником. В каждом хорошо производят нуля «макет раны», скользя кончик по всей поверхности клетки от 12-часов 6-часов место.Примечание: Три фактора, которые значительно повлияют на согласованности являются скорость, давление и угол кончика. Нуля должно выполняться быстро, с постоянным давлением, учитывая угол кончика, оставаясь перпендикулярным основанию пластины. Слишком медленно царапин вызовет кривых линий, избыточное давление может постоянно Оценка присоединения поверхности клетки и кончик угол меньше, чем 90° будет сузить ширину нуля. Любой из этих распространенных ошибок может привести к миграции изменены тарифы и шаблоны. Убрать лишний мусор и клеток сгустки промыв с 1 мл раствора сбалансированного солевого раствора в колодец. Рок плита–бокового для облегчения стирки. Сбалансированного солевого раствора из скважин и утилизируют в контейнер для отходов. Выбрасывайте биологической Бен кончика пипетки 5 мл. Рисунок 1: Схематическое представление нуля assay. Вся работа осуществляется в рамках асептических поле, чтобы уменьшить вероятность заражения. Клетки осеменены на желаемой плотности в культуре ткани колбы и вырос в инкубаторе, набор для человеческого физиологических условиях (5% CO2, 37 ° C). После достижения желаемого слияния, клетки асептически югу культивировали в культуре ткани 12-ну пластины на желаемой плотности посева. Клетки выращивают до 100% слияния в каждой скважине пластину 12-Ну и почесал с помощью кончика стерильные пипетки. Этот «нуля» создает в vitro макет раны (обозначается двойной возглавлял стрелки), в котором клетки мигрируют естественно чтобы закрыть открытое пространство. Каждый хорошо может быть однозначно кондиционерами и уровень клеточной миграции может быть замечен и количественно в ответ на различные лечения условий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Используйте p1000 дозаторов с наконечником 1000 мкл для 1000 мкл накапайте из запасов мышьяка в скважины, которые случайно были назначены с группой лечения. Используйте новый наконечник пипетки для каждой скважины для предотвращения перекрестного загрязнения. Запишите время, когда добавляются лечения. Поместите пластины для 12-Ну в инкубаторе в 37 ° C и 5,0% CO2. 6. обработка изображений Захват изображения каждого из скважины на 10 объективных кратном каждые 4 ч в течение 24 ч (0, 4, 8, 12, 16, 20 и 24 ч). Ссылаться на ранее линия на нижней части пластины для изображения же расположение вдоль царапины в течение каждой скважины в последующее время точках.Примечание: Важно, что в тех же местах фотографируются в каждый момент времени для проведения анализа точных изображений и для получения репрезентативных данных. 7. анализ Загружать изображения, снятые на Перевернутый световой микроскоп на компьютер и сохранить как JPEG-изображение с именем подробного файла. Откройте ImageJ. Загрузите изображение стадии микрометра с известными расстояния на программное обеспечение для преобразования пикселей в миллиметрах (мм), когда замеры изображения, перетаскивая файл в окно программы.Примечание: Микрометра должны иметь линии демаркации известный 1 мм длиной и изображения должны быть приняты на же масштаб, используемый для захвата изображения клеток. Например в этом исследовании, что изображения были взяты на 100 X общее увеличение, таким образом, изображение микрометра стадии было принято на 100 X общее увеличение. Нажмите кнопку Параметры прямой, сегментированныхили Произвольные линии . Нарисуйте линию известных расстояния на изображении микрометра с помощью деления с длиной, связанный с каждым тиком знаки. Чтобы нарисовать прямую линию: нажмите кнопку мыши, удерживая, перетащите курсор в нужное место, затем отпустить мыши. Выберите анализировать , а затем выберите Задать масштаб. Задайте Известный расстояние до известной длины линии, нарисованной в предыдущем шаге. Задайте единицу длины мм. Установите флажок с учетом глобальной. Выберите OK для выхода из меню. Закройте из сценический образ микрометра. Загрузка одного изображения нуля пробирного в ImageJ, перетаскивая и снижается файл изображения в окне. Рисование прямой линии по всей ширине нуля (от левого края ведущих к правому краю ведущий). Нажмите букву M на клавиатуре для записи измерения прямой линией. Небольшое окно результаты появятся сразу же после ввода буквы М. Это где будет измерение ширины. Повторите шаг 7.4 в общей сложности 10 раз для получения 10 измерений по длине нуля.Примечание: Это имеет важное значение для создания наиболее репрезентативного значения ширины вниз по всей длине нуля. Убедитесь, что пространство из измерения 10 ширину равной по длине нуля сверху донизу. Создайте файл электронной таблицы скретч пробирного для копирования и вставки измерения. Скопируйте и вставьте 10 ширины измерений из окна результаты в соответствующий столбец в файле электронной таблицы (Таблица 2).Примечание: Когда измерения копируются из окна результаты и вставлены в таблицу, будет лишние столбцы значений; Эти значения следует исключить, сохраняя только 10 ширины измерений. 10 случайных ширина измерения 0 h 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 В среднем 10 измерений В таблице 2. Сырые ширина измерения таблицы формат. Эта таблица показывает организационной структуры для сырых измерений получены. Повторите шаг выше на оставшуюся часть изображения нуля пробирного. Вычислить среднее 10 измерений в каждой точке времени (0-24 ч) за каждый хорошо. Определите, что процент закрытия вычисления, используя значения из шага 7,8. Создание таблицы в нижней части таблицы под названием «ширина измерения средние» (Таблица 3). Копировать и вставить строку Средний 10 измерений рассчитывается в шагом 7,8 в таблицу «Измерение ширины средние». Создайте другой таблицы рядом с Средние измерения ширины таблицы. Название это таблица Закрытия раны процентов (Таблица 4).Примечание: Значение в столбце 0 h для каждой скважины должна быть 0, потому что нуля 0% закрыт на первоначальный 0 h фото для всех скважин. Перейдите к следующему столбцу над (4 ч). Рассчитайте процент закрытия для 4, 8, 12, 16, 20 и 24 h моменты времени:где x = процент закрытия, я = ширина начального нуля (0 h ширина), f = ширина заключительного нуля (4, 8, 12, 16, 20 или 24 h ширина). А ширина средние 0 h 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h 1a 2a 3А 4A 1b 2b 3b 4b 1c 2c 3c 4c В таблице 3. Измерение ширины средние формат таблицы. Эта таблица показывает организационной структуры для средние измерения ширины, рассчитанных с использованием сырья ширина измерения в таблице 2. Колодец 0 h 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h 1a 0 2a 0 3А 0 4A 0 1b 0 2b 0 3b 0 4b 0 1c 0 2c 0 3c 0 4c 0 Таблица 4 . Процент раны закрытие формат таблицы. Эта таблица показывает организационной структуры для рассчитаны значения закрытия процент раны с помощью измерения ширины в среднем в таблице 3. Создайте другой таблицы рядом с таблицей, Процент закрытия раны . Это название таблицы КОСС (Таблица 5). Вычислить 0-4 h площадь под кривой (AUC) значение в 0-4 h столбец для каждой скважины:где x = 0-4 h значение AUC, = % закрытия значение 0 h, b = значение закрытия % за 4 ч, h = время между двумя мер (4 ч. в этом исследовании). Вычислите 4-8 ч площадь под кривой (AUC) значение в столбце 4-8 ч для каждой скважины:Где x = значение AUC 4-8 ч, = % закрытия значение для 4 h, b = значение закрытия % за 8 ч, h = время между двумя мер (4 ч. в этом исследовании).Примечание: Одно значение AUC должен рассчитываться для каждого интервала времени 4 ч в течение 24 ч для каждой скважины. Сумма всех значений АУК от 0-24 ч (рассчитывается в шаги 7.10.1-7.10.2) для получения значения суммируются AUC для каждой скважины. Убедитесь, что правильно, эти значения сохраняются для статистического анализа. Колодец 0-4 h 4-8 ч 8-12 ч 12-16 ч 16-20 h 20-24 ч Суммируются AUC 1a 2a 3А 4A 1b 2b 3b 4b 1c 2c 3c 4c В таблице 5. Формат таблицы КОСС. Эта таблица показывает организационной структуры для AUC значения, вычисленные с использованием процент раны закрытия значения в таблице 4. 8. Статистический анализ Определите метод статистического анализа, который лучше всего подходит как экспериментальный дизайн, так и суммируются значения АУК, полученные в ходе анализа.