In Vitro Scratch test per dimostrare gli effetti dell'arsenico su migrazione delle cellule della pelle

1. preparazione di un armadio di sicurezza biologica II (BSC) Nota: I metodi descritti in questo protocollo dovrebbero essere condotta con dispositivi di protezione individuale, durante l’utilizzo di buone pratiche di laboratorio per ottenere una tecnica asettica. Sollevare il vetro di protezione BSC per altezza di funzionamento e girare su ventilatori a flusso laminare. Per eseguire un wipe di risanamento dell’area di lavoro, utilizzare 70% soluzione acquosa di isopropanolo. Pulire BSC dalla parete posteriore e pareti laterali e lavorare verso il basso per la piastra di base. Pulire tutti i materiali che verranno utilizzati nell’analisi con alcool al 70% (isopropanolo o EtOH) e inserirli all’interno di BSC. 2. umani fibroblasti cutanei semina in una boccetta di T75 Ottenere fiale con la linea di cella desiderata crioconservati (neonatale fibroblasti cutanei umani [hDFn], a concentrazione di cellule di 500.000 cellule/flaconcino e passaggio p3 – p5). Posizionare un flaconcino con cellule a profondità di 1,0 cm bagnomaria a 37 ° C per consentire lo scongelamento. Scongelare il flaconcino fino a circa il 70% di soluzione di cella è liquido. Strofinare il flaconcino con alcool al 70% e posizionare la cuvetta nel rack flacone all’interno di BSC.Nota: Assicurarsi acqua non venga a contatto con il thread o il tappo del flaconcino per evitare la potenziale contaminazione durante la semina cellulare. Evitare lo scongelamento completo delle cellule in acqua del bagno come non farlo potrebbe causare morte cellulare non intenzionale. Tirare fuori 10 mL di media supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS). Utilizzare un pipettatore automatico e la punta della pipetta 10ml per aspirare in T75 matraccio di cultura del tessuto. Lasciare che supporti completamente per saturare la base del pallone da delicatamente a dondolo avanti e indietro il pallone. Fiala aperta con soluzione di cella stock e aspirare dalla fiala, memori del pipettaggio velocità, come le membrane cellulari saranno vulnerabile da crioconservazione. Trasferire le cellule in un pallone di tessuto T75 con i media. Espellere la cella scongelato nel pallone di tessuto, ancora memori del pipettaggio velocità.Nota: Semina la densità delle cellule nella beuta di tessuto è approssimata da 6.600 cellule/cm2. Densità di semina può essere modificato per accogliere l’utente e l’intervallo di tempo desiderato di sperimentazione. Misurare 1 mL di media da boccetta tessuto T75 e trasferire il volume nuovamente dentro il flaconcino. Trasferire il volume dal flaconcino indietro nel pallone T75.Nota: Eseguire questo passaggio consente di massimizzare il rendimento delle celle dal flaconcino. Stringere il tappo del flacone di coltura del tessuto e scuotere delicatamente per disperdere uniformemente le cellule in sospensione su tutta la superficie. Controllo per la distribuzione uniforme delle celle utilizzando un microscopio invertito. Boccetta di etichetta con il tipo di cella, data, iniziali, lignaggio e scopo (ad es., hDFn, 11/07/2018, NDC, Passage 4, arsenico Scratch test). Posto matraccio di cultura del tessuto in un incubatore a 37 ° C e 5,0% CO2 per 72 h.Nota: Crescita medio dovrebbe essere cambiato 12-24 h dopo la semina iniziale per rimuovere tracce di solfossido dimetilico (DMSO) cryopreservative e poi cambiato ogni 48 h dopo che affinché le cellule siano adeguatamente nutrite. Il periodo di incubazione e crescita dipenderà il numero calcolato di cellule necessarie per il dosaggio di gratta e Vinci. Il tempo di raddoppiamento per hDFn cellule è in genere 16-24 h in condizioni normali. Tuttavia, raddoppiando tariffa può cambiare a causa di elevazione, pH, temperatura, umidità, tipo medio, ecc.e devono essere contabilizzato durante la pianificazione di esperimenti. 3. cellula contando e sottocultura nel tessuto 12-pozzetti cultura piastra Recuperare il matraccio di cultura del tessuto T75 dall’incubatore. Osservare le cellule aderite utilizzando un microscopio invertito a ingrandimento obiettivo 10x (100 X totale ingrandimento) e determinare la confluenza di approssimativa delle cellule. Scansione, la maggior parte del matraccio di cultura del tessuto quando osservando la confluenza per garantire la percentuale più rappresentativa è approssimata. Valutare la morfologia delle cellule individuali per eventuali anomalie o per contaminazione batterica e/o fungine. Assemblare il pipettatore automatico con una punta di pipetta 10ml. Utilizzare pipettatore per aspirare il volume completo di supporto dalla soluzione T75 e trasferimento da un contenitore per rifiuti. Impedire il puntale di contatto con la superficie aderente delle cellule. Gettare il puntale della pipetta in un bidone di biohazard. Assemblare il pipettatore automatico con una punta di pipetta 5ml. Aspirare 5 mL della soluzione salina bilanciata, dispensare nel pallone e scuotere delicatamente il pallone per sciacquare il terreno in eccesso, le cellule morte e prodotto di scarto. Disegnare il volume dalla T75 e versare nel contenitore per rifiuti. Scartare il puntale della pipetta nel contenitore di biohazard. Assemblare il pipettatore automatico con un adattatore di pipetta 5ml. Aspirare 2 mL di tripsina da stock, dispensare nel pallone e scuotere delicatamente il pallone per disperdere l’enzima sopra le cellule aderite. Garantire la completa saturazione della superficie aderente. Posizionare il pallone del tessuto nell’incubatore per 2-3 minuti (min).Nota: La reazione enzima-substrato massima non deve superare 10 min. Osservare il matraccio di tessuto sotto un microscopio invertito a un ingrandimento 10x lente dell’obiettivo (100 X totale ingrandimento). Applicare le vibrazioni dolce per facilitare il distacco delle cellule. Pulire il matraccio T75 con alcool al 70% e posto all’interno di BSC. Assemblare il pipettatore automatico con una punta di pipetta 5ml. Aspirare 5 mL di media dal tallone e aggiungere nel matraccio di tessuto T75 per arrestare la reazione enzima-substrato. Il rapporto di media: tripsina dovrebbe essere 3:1. Dispensare su e giù per la base del pallone di 2 – 3 volte per sciacquare e garantire che la reazione è stata interrotta. Aspirare l’intero volume di fluido dalla boccetta e trasferimento in una provetta conica sterile 15 mL. Riempire una seconda provetta conica da 15 mL con un volume identico di media. Collocare entrambi provette coniche da 15 mL in posizione antipodale ad uno altro. Applicare 200 g di forza centrifuga per 5 minuti a 25° C mediante l’impostazione parametri di funzionamento dell’apparecchiatura. Pulire il tubo conico da 15 mL con cellule pellettate con alcool al 70% e posto all’interno di BSC. Usare il pipettatore automatico con un accessorio di 5ml per dispensare i mezzi di comunicazione, lasciando dietro di sé circa 250 µ l di liquido e cellule di pellet. Prestare attenzione alla posizione della punta della pipetta, in quanto il pellet cellulare dovrebbe rimanere indisturbato. Erogazione del volume raccolto in un contenitore per rifiuti ed eliminare la punta in un bidone di biohazard. Utilizzare una cremagliera del tubo del microcentrifuge per eseguire il fondo della provetta conica attraverso le fessure del flaconcino, creando una vibrazione rapida, per disturbare e risospendere il pellet cellulare (a volte chiamato “rack rastrellando”).Nota: Evitare di utilizzare un miscelatore vortex per eseguire questo passaggio. Le forze di gravità create da agitatori vortex superano le soglie di g-force di cella e possono causare lisi. Una volta completato correttamente, la nuova soluzione di cella apparirà come una miscela nuvolosa con nessuna pallina restante. Diligenza, eseguire questo passaggio creerà spesso una sospensione unicellulare, che conduce a una maggiore precisione quando si contano le cellule. Aggiungere 2 mL di media alla cellula stock o risospensione. Dispensare le cellule delicatamente lungo il lato del tubo 20 volte per rompere eventuali grumi. Registrare il volume di sospensione totale delle cellule e accantonato brevemente. Pipettare 20 µ l di brodo di Trypan Blue (0,4%) in un pozzetto vuoto di una piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta sterile. Miscelare la soluzione di riserva delle cellule per generare una sospensione cellulare uniforme prima del trasferimento. Utilizzare una punta di pipetta sterilizzata per rimuovere 20 µ l di cellula stock (evitando di toccare le pareti del tubo). Aggiungere i 20 µ l di soluzione di blu di Trypan della piastra a 96 pozzetti. Pipettare delicatamente per mescolare il contenuto. Pipettare 10 µ l della miscela tra il vetrino coprioggetto ed il conteggio della camera sull’emocitometro. Osservare le cellule e la griglia sotto un obiettivo 10x. Osservare nove grandi piazze all’interno del campo visivo. Contare le celle solo nel centro e 4 caselle d’angolo (totale di 5 quadrati).Nota: Guardare per una distribuzione uniforme delle cellule attraverso l’intera griglia per garantire un conteggio accurato. Tally tutte le cellule (trasparente e blue) in 5 piazze identificate della griglia. Separatamente, tally solo le cellule non vitali (blue) in 5 quadrati dello stesso. Calcolare cellule vitali conteggio utilizzando:dove x = numero di cellule vitali, un = cellule totali, b = cellule non vitali Calcolare la densità di cellule vitali utilizzando:dove x = densità di cellule vitali e y = somma totale delle cellule vitali. Calcolare totale cellule vitali:dove x = totale cellule vitali, y = densità di cellule vitali, f = volume (mL) di sospensione di cellule. Calcolare la vitalità cellulare %:dove x = percentuale di attuabilità, y = cellule vitali ha conteggiate sulla griglia, f = totale cellule contate sulla griglia. Tracciare una linea orizzontale attraverso il fondo del piatto 12-pozzetti per servire come punti di riferimento durante la formazione immagine. Utilizzare la densità di cellule vitali (calcolata in 3.3.7) per calcolare il volume dei media per diluire cella stock in una piastra di coltura del tessuto 12-pozzetti di semina.Nota: La cella ottima densità per hDFn cellule di semina è 5.000 cellule/cm2. Diluire la cellula stock a 19.000 cellule/mL utilizzando mezzi di comunicazione e ogni bene con 1 mL di cellula stock di semi. Mescolare il brodo di cella periodicamente per garantire anche cellula semina attraverso tutti i 12 pozzetti. Etichettare ogni piatto con il tipo di cella, il lignaggio, le iniziali dell’utente e lo scopo. Piastre di posto in incubatrice impostato a 37 ° C e 5,0% CO2. Consentire alle cellule di crescere fino a 100% confluenza è raggiunto per l’analisi di gratta e Vinci. 4. arsenico (As) soluzioni di riserva e calcoli Diluire arsenito del sodio (NaAsO2) direttamente nel terreno di coltura delle cellule con 10% FBS alle concentrazioni di lavoro di 10, 1.0, 0,1 e 0,01 µM come. Per questo, è necessario fare uno stock iniziale 1 mM come soluzione diluendo 3,9 mg di arsenito del sodio in 30 mL di media. In serie diluire lo stock di 1 mM per il restante come soluzioni. 1000 µM come Stock Calcoli Lavoro d’archivio concentrazioni di arsenico M1V1= M2V2 Volume della soluzione precedente di arsenico Volume di Media Volume totale di arsenico lavorando Stock Peso molecolare di NaAsO2 : 129,9 g/mol 10 µM come (x mL) (1.000 µM) = (30 mL)(10 µM) x = 0,3 mL 0,3 mL = 300 µ l di 1mM come soluzione Diluitore mL 29,7 30 .03 L x.001 mol/L x 130 g/mol = 3,9 mg di arsenico 1,0 µM come (x mL) (10 µM) = (30 mL)(1 µM) x = 3 mL 3 mL di 10 µM come soluzione 27 mL di media 30 Diluire 3,9 mg di arsenito del sodio in media 30 mL 0.1 µM come (x mL) (1 µM) = (30 mL)(0.1 µM) x = 3 mL 3 mL di 1 µM come 27 mL di media 30 0.01 µM come (x mL) (0,1 µM) = (30 mL)(0.01 µM) x = 3 mL 3 mL di 0.1 µM come 27 mL di media 30 Tabella 1. Stock di arsenico e diluizioni seriali. Questa tabella spiega i calcoli utilizzati per creare le soluzioni stock As e soluzioni di riserva per i gruppi di trattamento di lavoro. 5. grattare la tecnica e la contaminazione da arsenico Ottenere un piatto di 12 pozzetti con cellule dall’incubatrice. Mostra le cellule a un 10x di ingrandimento dell’obiettivo (100 X totale ingrandimento). Determinare la confluenza delle cellule all’interno di ciascun pozzetto.Nota: Ogni singolo bene deve raggiungere 100% confluenza prima di graffiare. Questo passaggio critico assicura la coerenza all’interno del dosaggio e aiuta a standardizzare i protocolli di analisi attraverso esperimenti. Se qualsiasi pozzi non hanno raggiunto la confluenza di 100%, permettono alle cellule di incubare per ulteriore tempo finché tutti i pozzetti hanno raggiunto la confluenza di 100%. Tempo di crescita supplementare in pozzi che hanno già raggiunto la confluenza di 100% non ne risentiranno. Cellule confluenti in genere diventerà crescita arrestato e rimangono come una coltura dello strato monomolecolare, consentendo nel contempo Sub-confluenti Pozzi raggiungere 100% confluenza. Assemblare un pipettatore automatico con una punta di pipetta 10ml. Aspirare i media di crescita fuori tutti i pozzetti. Eliminare il volume di rifiuti liquidi e la punta della pipetta nella collocazione di rischi biologici. Assemblare un pipettatore p200 con punta sterile 1-200 µ l. In ciascun pozzetto, produrre un graffio “finto ferita” facendo scivolare la punta sulla superficie delle cellule da un-ore 12 a ore 6 posizione.Nota: Tre fattori che influenzeranno notevolmente la consistenza sono velocità, pressione e l’angolo di punta. Il graffio deve essere eseguito rapidamente, con una pressione costante, pur essendo consapevoli dell’angolo punta stare perpendicolare alla base del piatto. Graffiare troppo lentamente causerà righe storte, eccesso di pressione permanentemente può segnare superfici aderente delle cellule e un angolo di punta meno di 90° restringerà la larghezza gratta e Vinci. Uno di questi errori comuni può causare alterata migrazione tariffe e modelli. Sgombrare il campo da ciuffi di detriti e delle cellule in eccesso risciacquando con 1 mL di soluzione salina bilanciata per pozzetto. Il piastra lato a lato per facilitare il lavaggio della roccia. Rimuovere la soluzione salina bilanciata da pozzi e gettare in un contenitore per rifiuti. Smaltire la punta della pipetta 5ml nel bidone rischi biologici. Figura 1: rappresentazione schematica del dosaggio zero. Tutto il lavoro è fatto all’interno di un campo asettico per diminuire la probabilità di contaminazione. Le cellule sono seminate ad una densità desiderata in recipienti di coltura del tessuto e coltivate in un incubatore impostato su condizioni fisiologiche umane (5% CO2, 37 ° C). Dopo aver raggiunto una confluenza desiderata, le cellule sono asetticamente Sub-coltivate in piastre di coltura del tessuto 12-pozzetti ad una densità di semina desiderata. Le cellule sono coltivate alla confluenza del 100% in ciascun pozzetto della piastra 12-pozzetti e graffiato utilizzando una punta di pipetta sterilizzata. Questo “zero” crea una in vitro finto ferita (contrassegnata da una freccia a due punte), in cui le cellule migrano naturalmente per chiudere lo spazio all’aperto. Ogni bene può essere univocamente condizionato e tassi di migrazione cellulare possono essere osservati e quantificati in risposta a diverse condizioni di trattamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Utilizzare una pipetta p1000 con una punta di 1.000 µ l per dispensare 1.000 µ l dalle scorte di arsenico in pozzetti, che sono stati assegnati in modo casuale con un gruppo di trattamento. Utilizzare un nuovo puntale per ciascun pozzetto per evitare la contaminazione incrociata. Registrare il tempo quando i trattamenti vengono aggiunti. Posto 12-pozzetti in un incubatore a 37 ° C e 5,0% CO2. 6. imaging Catturare immagini di ciascun pozzetto a 10x di ingrandimento obiettivo ogni 4 h per un periodo di 24 h (0, 4, 8, 12, 16, 20 e 24 h). La linea precedentemente disegnata sul fondo del piatto per la stessa ubicazione lungo il graffio all’interno di ciascun pozzetto a intervalli di tempo successivi immagine di riferimento.Nota: È fondamentale che le stesse posizioni sono fotografati in ogni momento per consentire analisi accurata delle immagini e di ottenere dati rappresentativi. 7. image Analysis Caricare immagini acquisite con il microscopio ottico invertito a un computer e salvare come immagine JPEG con un nome di file dettagliato. Aprire ImageJ. Caricare un’immagine di un micrometro con distanze conosciute al software per convertire i pixel in millimetri (mm) quando si eseguono misure immagine trascinando e rilasciando il file nella finestra del software.Nota: Il micrometro dovrebbe avere linee che delimitano un noto 1 mm lunghezza e l’immagine deve essere presa allo stesso ingrandimento utilizzato per catturare le immagini delle cellule. Ad esempio, in questo studio di immagini sono state scattate a 100x ingrandimento totale, così l’immagine del micrometro è stata presa a 100 X ingrandimento totale. Fare clic sulle opzioni dritto, segmentatio Linee a mano libera . Disegnare una linea di distanza nota sull’immagine micrometro usando i segni di graduazione con una lunghezza associata a ogni tick marks. Per disegnare una linea retta: clic del mouse, tenere premuto, trascinare il cursore alla posizione desiderata, poi lasciar andare del mouse. Selezionare analizza quindi Imposta scala. Impostare La distanza di noto alla nota lunghezza della linea disegnata nel passaggio precedente. Impostare unità di lunghezza di mm. La casella globale. Selezionare OK per uscire dal menu. Chiudere fuori l’immagine di micrometro di fase. Caricare uno scratch test immagine in ImageJ trascinando e eliminazione file di immagine nella finestra. Disegnare una linea retta su tutta la larghezza dello scratch (dal bordo di attacco sinistro a destra leading edge). Premere la lettera M sulla tastiera per registrare la misura della linea retta disegnata. Una piccola finestra di risultati appariranno immediatamente dopo aver digitato la lettera M. Questo è dove sarà la misura della larghezza. Ripetere il passaggio 7.4 un totale di 10 volte per ottenere 10 misurazioni lungo la lunghezza dello scratch.Nota: È importante generare i valori di larghezza più representational giù l’intera lunghezza del graffio. Assicurati di distanziare le misure di 10 larghezza altrettanto lungo la lunghezza del graffio dall’alto verso il basso. Creare un file di foglio di calcolo di analisi gratta e Vinci per copiare e incollare le misurazioni. Copiare e incollare le misure di 10 larghezza dalla finestra risultati nella colonna appropriata in un file di foglio di calcolo (tabella 2).Nota: Quando le misure sono copiate dalla finestra dei risultati e incollate nel foglio di calcolo, ci sarà estranee colonne di valori; questi valori devono essere eliminati, conservando solo le misure di 10 larghezza. 10 misure di larghezza casuale h 0 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Media di 10 misure Tabella 2. Misure di larghezza crudo tabella formato. Questa tabella mostra la struttura organizzativa per il crude misure ottenute. Ripetere il passaggio precedente per il resto delle immagini scratch test. Calcolare la media di 10 misure in ogni punto del tempo (0-24 h) per ogni pozzetto. Determinare per cento chiusura calcoli utilizzando i valori dal passaggio 7,8. Creare una tabella a parte inferiore del foglio di lavoro dal titolo “Larghezza misura medie” (tabella 3). Copia e incolla in che la riga di Media di 10 misure calcolata passo 7,8 nella tabella “misura larghezza medie”. Creare un’altra tabella accanto alla tabella di Larghezza misura medie . Titolo questo tavolo Chiusura della ferita per cento (tabella 4).Nota: Il valore nella colonna h 0 per ciascun pozzetto deve essere 0 perché il graffio è 0% chiuso la foto iniziale h 0 per tutti i pozzetti. Passare alla colonna successiva sopra (4 h). Calcolare la percentuale chiusura per 4, 8, 12, 16, 20 e intervalli di tempo di 24 ore:dove x = percentuale di chiusura, io = larghezza zero iniziale (0 h larghezza), f = finale zero width (larghezza 4, 8, 12, 16, 20 o 24 h). Beh larghezza medie h 0 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h 1a 2a 3A 4a 1b 2B 3B 4B 1c 2c 3c 4c Tabella 3. Misurazione della larghezza media di formato di tabella. Questa tabella mostra la struttura organizzativa per le medie di misura larghezza calcolate utilizzando le misure di larghezza non definita nella tabella 2. Bene h 0 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h 1a 0 2a 0 3A 0 4a 0 1b 0 2B 0 3B 0 4B 0 1c 0 2c 0 3c 0 4c 0 Tabella 4. Per cento della ferita formato di tabella di chiusura. Questa tabella mostra la struttura organizzativa per i valori di chiusura della ferita delle percentuali calcolate utilizzando la misura della larghezza medie in tabella 3. Creare un’altra tabella accanto alla tabella di Chiusura della ferita per cento . Titolo questo tavolo AUC (tabella 5). Calcolare il 0-4 h area sotto il valore di curva (AUC) in 0-4 h colonna per ciascun pozzetto:dove x = 0-4 h valore AUC, a = valore di chiusura % per h 0, b = valore di chiusura % per 4 h, h = il tempo tra le due misure (4 h in questo studio). Calcolare l’area di 4-8 h sotto il valore di curva (AUC) nella colonna 4-8 h per ciascun pozzetto:Dove x = 4-8 h AUC valore, un = valore di chiusura % per 4 h, b = valore di chiusura % per 8 h, h = il tempo tra le due misure (4 h in questo studio).Nota: Una AUC valore deve essere calcolato per ogni intervallo di tempo di 4 ore durante il periodo di 24 ore per ciascun pozzetto. Sommare tutti i valori AUC da 0-24 h (calcolato in passaggi 7.10.1-7.10.2) per ottenere un valore AUC sommato per ciascun pozzetto. Garantire che questi valori vengono salvati correttamente per l’analisi statistica. Bene 0-4 h 4-8 h 8-12 h 12-16 h 16-20 h 20-24 h Sommati AUC 1a 2a 3A 4a 1b 2B 3B 4B 1c 2c 3c 4c Tabella 5. Formato di tabella AUC. Questa tabella mostra la struttura organizzativa per i valori AUC calcolate utilizzando la percentuale di ferita valori di chiusura nella tabella 4. 8. elaborazione statistica Determinare il metodo di analisi statistica che meglio si adatta il disegno sperimentale e il valori AUC sommati ottenuti durante il dosaggio.