In-vitro- Kratzen Sie Assay veranschaulichen Auswirkungen von Arsen auf Haut Zellwanderung

1. Vorbereitung eines Biosafety II-Kabinetts (BSC) Hinweis: Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden sollten mit persönlichen Schutzausrüstungen, während mit der guten Laborpraxis zu aseptischen erreichen durchgeführt werden. Heben Sie das BSC-Schutzglas, Arbeitshöhe und Laminar-Flow-Ventilatoren einschalten. Verwenden Sie 70 % Isopropanol wässriger Lösung um ein Hygiene-Abwischen des Arbeitsbereichs durchzuführen. Wischen Sie BSC von der Rückwand und Seitenwände und arbeiten auf der Grundplatte. Wischen Sie alle Materialien, die in der Probe mit 70 % Alkohol (Isopropanol oder EtOH) verwendet werden und legen Sie sie in den BSC. (2) menschlichen dermalen Fibroblasten Aussaat in ein Auffanggefäß T75 Fläschchen mit der gewünschten kryokonservierten Zelllinie (neonatale menschlichen dermalen Fibroblasten [hDFn] Zellkonzentration von 500.000 Zellen/Vial und Durchgang p3-p5) erhalten. Platzieren Sie ein Fläschchen mit Zellen in einem 1,0 cm tiefen Wasserbad bei 37 ° C, auftauen lassen. Tauen Sie Fläschchen, bis ca. 70 % der Zelle Lösung flüssig ist. Fläschchen mit 70 % Alkohol wischen Sie ab und Fläschchen in Vial Rack im BSC.Hinweis: Stellen Sie sicher, dass Wasser nicht in Kontakt mit Fäden oder Kappe der Durchstechflasche zu potentiellen Kontamination während der Zelle Aussaat zu verhindern kommen. Zu verhindern, komplett Auftauen der Zellen im Wasser Baden, da andernfalls unbeabsichtigte Zelltod führen kann. Ziehen Sie 10 mL Medien ergänzt mit 10 % fetalen Bovine Serum (FBS). Verwenden Sie eine automatische Pipette und 10 mL Pipette Tipp um in T75 Gewebekultur Flasche abzusaugen. Können Sie Medien voll sättigen die Basis des Kolbens durch sanft schaukelnden den Kolben hin und her. Geöffnet Fläschchen mit Zelle Lager und Aspirat Lösung aus der Durchstechflasche, achtsam Pipettieren Geschwindigkeit wie Zellmembranen von Kryokonservierung gefährdet wird. Übertragen Sie Zellen auf einem T75 Gewebe Kolben mit Medien. Werfen Sie aufgetauten Zellen in Gewebe Kolben wieder achtsam Pipettieren Geschwindigkeit aus.Hinweis: Seeding Dichte der Zellen im Gewebe Kolben zu 6.600 Zellen/cm2angenähert ist. Dichte Aussaat kann geändert werden, um die Benutzer und die gewünschte Zeitpunkt des Experimentierens unterzubringen. Medien aus T75 Gewebe Flasche 1 mL abmessen und Volumen zurück in die Flasche zu übertragen. Übertragen Sie Volumen aus dem Fläschchen zurück in den Kolben T75.Hinweis: Dieser Schritt hilft Zellausbeute aus der Durchstechflasche zu maximieren. Ziehen Sie die Gewebekultur Kolben Mütze und schütteln um Zellen in Suspension gleichmäßig über die gesamte Fläche zu verteilen. Überprüfen Sie für eine gleichmäßige Verteilung der Zellen mit einem inversen Mikroskop. Etikett Flasche mit Zelltyp, Datum, Initialen, Herkunft und Zweck (z.B. hDFn, 11.07.2018, NDC, Abschnitt 4, Arsen-Scratch-Assay). Gewebekultur Kolben in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5,0 % CO2 72 h zu platzieren.Hinweis: Wachstumsmedium sollte geänderte 12-24 h nach der ersten Aussaat um Spuren von Dimethyl Sulfoxid (DMSO) cryopreservative zu entfernen, und dann verändert alle 48 h danach um sicherzustellen, dass die Zellen richtig ernährt werden. Die Inkubation und Wachstum Zeitraum hängt die berechnete Anzahl von Zellen für den Scratch-Test benötigt. Die Verdopplungszeit für hDFn Zellen ist in der Regel 16-24 h unter normalen Bedingungen. Jedoch verdoppeln kann aufgrund der Höhe, pH-Wert, Temperatur, feuchte, Medientyp, etc.ändern, und muss bei der Planung von Experimenten berücksichtigt werden. 3. Zelle zählen und Subkultur in 12-Well Tissue Culture Platte T75 Gewebekultur Kolben aus Inkubator abrufen. Beobachten Sie eingehalten mit einem inversen Mikroskop bei 10 X Objektiv Vergrößerung (100 X Gesamtvergrößerung) Zellen zu und bestimmen Sie die ungefähre Zelle Zusammenfluss. Scannen Sie den Großteil der Gewebekultur-Kolben, wenn beobachten Zusammenfluss Sicherstellung den repräsentativsten Prozentsatz angenähert wird. Einzelne Zelle Morphologie für Auffälligkeiten oder bakterielle oder Pilzinfektionen Kontamination zu bewerten. Montieren Sie die automatische Pipette mit einer 10 mL-Pipette-Spitze. Verwenden Sie Pipette, um das volle Volumen der Medien von der T75 und Transfer-Lösung zu einem Abfallbehälter Aspirieren. Kontaktaufnahme mit der anhaftenden Zelloberfläche Pipettieren Tipp zu verhindern. Entsorgen Sie Pipettenspitze in einen Biohazard Behälter. Montieren Sie die automatische Pipette mit einer Pipettenspitze 5 mL. Aspirieren Sie 5 mL der ausgeglichenen Salzlösung, verzichten in der Flasche und schütteln Sie die Flasche um überschüssige Medien, abgestorbene Zellen und Abfallprodukte zu spülen. Das Volumen aus dem T75 ziehen und in den Abfallbehälter zu verzichten. Entsorgen Sie die Pipettenspitze in die Biohazard bin. Montieren Sie die automatische Pipette mit 5 mL Pipette Adapter. Aspirieren 2 mL Trypsin ab Lager, verzichten in der Flasche und schütteln Sie die Flasche um das Enzym über die eingehalten Zellen zu verteilen. Vollständige Sättigung der anhaftende Oberfläche zu gewährleisten. Ort der Gewebe-Küvette in den Inkubator für 2-3 Minuten (min).Hinweis: Die maximale Enzym-Substrat-Reaktion sollte 10 min nicht überschreiten. Die Gewebe-Flasche unter einem inversen Mikroskop bei 10 X Objektiv Vergrößerung (100 X Gesamtvergrößerung) zu beobachten. Wenden Sie sanfte Schwingungen um die Zelle Loslösung zu erleichtern. Wischen Sie die T75-Flasche mit 70 % Alkohol und im Inneren der BSC. Montieren Sie die automatische Pipette mit einer Pipettenspitze 5 mL. Aspirieren Sie 5 mL von Medien aus dem Bestand und verleihen der T75 Gewebe Küvette, die Enzym-Substrat-Reaktion zu stoppen. Medien: Trypsin-Verhältnis sollte 3:1. Pipettieren auf und ab der Basis des Kolbens 2-3 Mal ausspülen und sicherstellen, dass die Reaktion gestoppt hat. Das komplette Volumen der Flüssigkeit aus der Flasche und Überführung in eine sterile 15 mL konische Rohr abzusaugen. Füllen Sie eine zweite 15 mL konische Rohr mit einem identischen Volumen von Medien. Legen Sie beide 15 mL konische Röhrchen in eine antipodische Position zueinander. Gelten Sie 200 g der Zentrifugalkraft für 5 min bei 25° C durch die Einstellung des Gerätes laufen Parameter. Wischen Sie die 15 mL konische Rohr mit gebeizte Zellen mit 70 % Alkohol und legen in der BSC. Verwenden Sie die automatische Pipette mit einer 5 mL-Bindung an Pipettieren von Medien, hinterließ rund 250 µL Flüssigkeit und Zelle Pellet. Achten Sie auf die Position der Spitze pipettieren, wie die Zelle Pellet ungestört bleiben sollte. Verzichten Sie die Lautstärke in einem Abfallbehälter gesammelt und entsorgen Sie die Spitze in einem Biohazard bin. Verwenden Sie eine Microcentrifuge Schlauch Rack, unten das konische Rohr auf die Fläschchen Schlitze, erstellen eine schnelle Schwingung, um zu stören und erneut aussetzen der Zelle Pellet (manchmal genannt “rack-Rechen”) laufen.Hinweis: Vermeiden Sie, mit einem Vortex-Mixer um diesen Schritt auszuführen. Erstellt von Vortex Mixer Gravitationskräfte Zelle g-Force Schwellenwerte überschreiten und Lyse verursachen. Wenn korrekt abgeschlossen, erscheint die neue Zelle-Lösung als eine trübe Mischung mit keine verbleibenden Pellets. Fleiß, die Durchführung dieses Schrittes wird oft eine einzelne Zelle Aufhängung, führt zu erhöhte Genauigkeit beim zählen von Zellen schaffen. Die Zelle Lager oder Wiederfreisetzung 2 mL Medien hinzufügen. Pipettieren der Zellen sanft auf der Seite des Rohres 20 Mal, um bis alle Klumpen zu brechen. Erfassen die gesamte Zellvolumen Aussetzung und beiseite kurz. Pipettieren 20 µL Trypan blau Lager (0,4 %) in einen leeren Brunnen einer 96-Well-Platte mit einer sterilen pipettieren. Mischen Sie die Lager Zelle Lösung um eine einheitliche Zellsuspension vor der Übertragung zu generieren. Verwenden Sie einen sterilen Pipettieren Tipp um 20 µL der Zelle Lager (Vermeidung berühren die Rohrwände) entfernen. Hinzu kommt die 20 µL Trypan blau-Lösung in der 96-Well-Platte. Pipettieren sanft, Inhalt zu mischen. Pipettieren 10 µL der Mischung zwischen dem Deckglas und die Zählung auf der Hemocytometer Kammer. Beobachten Sie die Zellen und das Raster unter einem 10 X-Objektiv. Beobachten Sie neun große Quadrate in das Blickfeld. Zählen von Zellen nur in der Mitte und 4 Eckquadrate (insgesamt 5 Kästchen).Hinweis: Suchen Sie eine gleichmäßige Verteilung der Zellen über das gesamte Netz um eine genaue Zählung zu gewährleisten. Decken Sie alle Zellen (transparent und blau) in die 5 identifizierten Quadrate des Gitters. Decken Sie separat, nur die zellfreie (blauen) Zellen in der gleichen 5 Quadrate. Lebensfähige Zelle zählen mit zu berechnen:wo X = Anzahl der lebensfähigen Zellen, ein = total Zellen, b = nicht lebensfähige Zellen Berechnen Sie die lebensfähigen Zelle Dichte mit:wo X = tragfähige Zelldichte und y = Summe der lebensfähigen Zellen. Berechnen Sie insgesamt vitaler Zellen:wo X = insgesamt vitaler Zellen, y tragfähige Zelldichte, f = = Aussetzung Zellvolumen (mL). Berechnen Sie % Zellviabilität:wo X = prozentuale Zellviabilität, y = lebensfähige Zellen gezählt auf Raster, f = total Zellen gezählt auf Raster. Markieren Sie eine horizontale Linie am unteren Rand der 12-Well-Platte als Referenzzeichen während der Bildgebung dienen. Verwenden Sie die tragfähige Zelldichte (gerechnet in 3.3.7) zu berechnen Sie das Volumen der Medien, Zelle vorrätig für die Aussaat einer Gewebekultur 12-Well-Platte zu verdünnen.Hinweis: Die optimale Zelle Dichte für hDFn Zellen Aussaat ist 5.000 Zellen/cm2. Zelle bestand bis 19.000 Zellen/mL zu verdünnen mit Medien und Saatgut jedes gut mit 1 mL der Zelle bestand. Mischen Sie Zelle bestand in regelmäßigen Abständen auch Zelle über alle 12 Brunnen Aussaat zu gewährleisten. Beschriften Sie jede Platte mit der Zelltyp, der Abstammung, die Benutzerinitialen und den Zweck. Platzieren Sie Platten im Inkubator auf 37 ° C und 5,0 % CO2festgelegt. Können Sie Zellen wachsen, bis 100 % Zusammenfluss für Scratch-Test erreicht wird. 4. Arsen (As) auf lagerlösungen und Berechnungen Natrium-Arsenat (Osteoporosis2) direkt in Zellkulturmedien mit 10 % verdünnen FBS bei Working-Konzentrationen von 10, 1,0 und 0,1 0,01 µM als. Hierzu stellen Sie eine anfängliche 1 mM Lager als Lösung durch Verdünnung 3,9 mg Natrium Arsenat in 30 mL der Medien. Seriell verdünnen Sie 1 mM Lager für die verbleibenden als Lösungen. 1000 µM als Lager Berechnungen Arsen arbeiten Lager Konzentrationen M1V1= M2V2 Volumen der vorherigen Arsen Lösung Volumen von Medien Gesamtvolumen von Arsen arbeiten Lager Osteoporosis2 Molekulargewicht: 129.9 g/Mol 10 µM als (x mL) (1.000 µM) = (30 mL)(10 µM) X = 0,3 mL 0,3 mL = 300 µL 1mM als Lösung 29,7 mL Medien 30 .03 L x.001 Mol/L X 130 g/Mol = 3,9 mg Arsen 1,0 µM als (x mL) (10 µM) = (30 mL)(1 µM) X = 3 mL 3 mL 10 µM als Lösung 27 mL Medien 30 Verdünnen Sie 3,9 mg Natrium Arsenat in 30 mL Medien Als 0,1 µM (x mL) (1 µM) = (30 mL)(0.1 µM) X = 3 mL 3 mL 1 µM als 27 mL Medien 30 0,01 µM als (x mL) (0,1 µM) = (30 mL)(0.01 µM) X = 3 mL 3 mL 0,1 µM als 27 mL Medien 30 Tabelle 1. Arsen Aktien und serielle Verdünnungen. Diese Tabelle erklärt die Berechnungen zur Erstellung der As-Stammlösungen und arbeiten auf Lagerlösungen für Behandlungsgruppen. (5) kratzen Sie Assay Technik und Arsen Verschmutzung Erhalten Sie eine 12-Well-Platte mit Zellen aus dem Inkubator. Sehen Sie Zellen auf einem 10 X Objektiv Vergrößerung (100 X Gesamtvergrößerung). Zelle Zusammenfluss innerhalb jedes gut zu bestimmen.Hinweis: Jedes einzelne gut muss 100 % Zusammenfluss vor verkratzen erreicht. Dieser entscheidende Schritt sorgt für Konsistenz innerhalb der Assay und hilft Assay Protokolle über Experimente zu standardisieren. Wenn Brunnen nicht 100 % Zusammenfluss erreicht haben, können Sie Zellen zu inkubieren zusätzliche Zeit bis alle Brunnen 100 % Zusammenfluss erreicht haben. Zusätzliches Wachstumszeit in Brunnen, die bereits 100 % Zusammenfluss erreicht haben bleiben unberührt. Konfluierende Zellen werden in der Regel Wachstum verhaftet werden und bleiben als Monolayer Kultur, wobei Sub konfluierende Brunnen, Zusammenfluss von 100 % zu erreichen. Montieren Sie eine automatische Pipette mit einer 10 mL-Pipette-Spitze. Aspirieren Sie das Wachstumsmedium aus allen Brunnen. Entsorgen Sie die Lautstärke in flüssiger Abfälle und die Pipettenspitze in die Biogefährdung bin. Montieren Sie eine p200-Pipette mit einer 1-200 µL steriler Spitze. Produzieren Sie in jede Vertiefung einen Kratzer “mock Wunde” gleiten die Spitze über Zelloberfläche von einer 12-Uhr auf 6-Uhr Position.Hinweis: Sind drei Faktoren, die Konsistenz stark beeinflussen, Geschwindigkeit, Druck und Spitzenwinkel. Der Kratzer sollte rasch, mit einem konstanten Druck durchgeführt werden, dabei denken Sie an die Spitzenwinkel senkrecht zur Basis der Platte zu bleiben. Zu langsam kratzen verursachen krumme Linien, Überdruck kann dauerhaft Punkten anhaftenden Zelloberflächen und eine Spitzenwinkel weniger als 90° Scratch breite schmal wird. Alle diese häufigen Fehler führt zu veränderten Migration Preise und Muster. Entfernen Sie überschüssige Schmutz und Zelle Klumpen durch Spülen mit 1 mL einer ausgeglichenen Salzlösung pro Bohrloch. Rock die Platte-seitliche Reinigung zu erleichtern. Entfernen Sie die ausgeglichene Salzlösung aus Brunnen und in einem Abfallbehälter zu entsorgen. Die Pipettenspitze 5 mL in den biologischen Behälter entsorgen. Abbildung 1: Schematische Darstellung des Scratch Assays. Alle Arbeit erfolgt im Rahmen einer aseptischen Bereich um die Möglichkeit einer Kontamination zu verringern. Zellen sind bei einer gewünschten Dichte im Gewebe Kulturflaschen ausgesät und gewachsen in einem Inkubator auf menschlichen physiologischen Bedingungen (5 % CO2, 37 ° C) festgelegt. Nach dem Erreichen eines gewünschten Zusammenfluss, sind Zellen Sub aseptisch in 12-Well-Zellkultur-Platten bei einer gewünschten Aussaatdichte kultiviert. Zellen werden zu 100 % Zusammenfluss in jede Vertiefung des 12-Well-Platte und zerkratzte mit einer sterilen Pipettieren Spitze angebaut. Diese “Scratch” schafft eine in-vitro- mock Wunde (gekennzeichnet durch Leitung Doppelpfeil), in der Zellen natürlich wandern um den offenen Bereich zu schließen. Jedes gut kann eindeutig konditioniert werden und zelluläre Migration Preise können beobachtet und in Reaktion auf verschiedene Behandlungsbedingungen quantifiziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Verwenden Sie eine Pipette p1000 mit 1.000 µL Spitze zu pipettieren 1.000 µL aus Arsen Bestände in Vertiefungen, die mit einer Behandlungsgruppe zugelost. Verwenden Sie einen neues Pipettieren Tipp für jedes gut, um Kreuzkontamination zu vermeiden. Notieren Sie die Zeit, wenn Behandlungen hinzugefügt werden. Platz 12-Well Platten im Brutschrank bei 37 ° C und 5,0 % CO2eingestellt. 6. Bildgebung Aufnahmen von jeder gut, 10 X Objektiv Vergrößerung alle 4 Std. über einen Zeitraum von 24 h (0, 4, 8, 12, 16, 20 und 24 h). Die Bezugslinie zuvor auf der Unterseite der Platte an der gleichen Stelle entlang der Kratzer innerhalb jedes gut zu späteren Zeitpunkten Bild gezeichnet.Hinweis: Es ist zwingend notwendig, dass die gleichen Standorte werden fotografiert, zu jedem Zeitpunkt ermöglicht präzise Bildanalyse und repräsentative Daten zu erhalten. 7. die Bildanalyse Laden Sie Bilder auf dem invertierten Lichtmikroskop an einen Computer erfasst und als ein JPEG-Bild mit einem ausführlichen Dateinamen speichern. ImageJ zu öffnen. Hochladen Sie ein Bild von einem Mikrometer Bühne mit bekannten Entfernungen zur Software Pixel in Millimetern (mm) zu konvertieren, wenn Bild Messungen per Drag & Drop die Datei in das Softwarefenster.Hinweis: Das Mikrometer sollten Linien Abgrenzung einer bekannten 1 mm Länge und der Aufnahme muss mit der gleichen Vergrößerung verwendet, um Bilder von Zellen zu erfassen. Zum Beispiel wurde in dieser Studie wurden die Bilder bei 100 X Gesamtvergrößerung, damit das Bild von der Bühne Mikrometer auf 100 X Gesamtvergrößerung getroffen. Klicken Sie auf den geraden, segmentierteoder Freihandlinien Optionen. Zeichnen Sie eine Linie von bekannten Abstand auf den Mikrometer-Bild mithilfe der Teilstriche mit einer Länge, die Verbindung mit jedem Tick Mark. Eine gerade Linie zu zeichnen: Klicken Sie mit Maus, halten, ziehen Sie den Cursor an die gewünschte Stelle, dann loslassen der Maus. Wählen Sie analysieren dann Maßstab gesetzt. Legen Sie Bekannt Abstand auf die bekannten Länge der Linie im vorherigen Schritt. Stellen Sie Einheit der Länge nach mm. Kontrollkästchen Sie das globale. Wählen Sie “OK” um das Menü verlassen. Schließen Sie das Stadium-Mikrometer-Bild. Bildgalerie ein Rubbellos Assay in ImageJ per Drag & Drop-Image-Datei in das Fenster. Zeichnen einer geraden Linie über die gesamte Breite des Kratzers (von der linken Vorderkante an rechten Vorderkante). Drücken Sie den Buchstaben M auf Tastatur, um die Messung der geraden Linie zu zeichnen. Ein kleines Fenster erscheint sofort nach der Eingabe der Buchstaben M. Dies ist, wo die Breitenmessung sein wird. Wiederholen Sie Schritt 7,4 insgesamt 10 mal 10 Messungen entlang der Länge des Kratzers.Hinweis: Es ist wichtig, die meisten gegenständliche Breitenwerte über die gesamte Länge des Kratzers zu generieren. Achten Sie darauf, die 10 Breite Messungen gleichmäßig entlang der Länge des Kratzers von oben nach unten Platz. Erstellen Sie eine Tabellenkalkulationsdatei Scratch-Test zum Kopieren und Einfügen der Messungen. Kopieren Sie und fügen Sie die 10 Breite Messungen im Ergebnisfenster in der entsprechenden Spalte in einer Tabellenkalkulationsdatei (Tabelle 2).Hinweis: Wenn die Messungen aus dem Ergebnisfenster kopiert und in das Tabellenblatt eingefügt, werden überflüssige Spalten mit Werten; Diese Werte sollten gelöscht werden, erhalten nur die 10 Breite Messungen. 10 zufällige breite Messungen 0 h 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Mittelwert aus 10 Messungen Tabelle 2: Rohe breite Messungen Tabelle Format. Diese Tabelle zeigt die Organisationsstruktur für die rohen Messungen. Wiederholen Sie die oben genannten Schritte für den Rest der Scratch-Test-Bilder. Berechnen Sie den Mittelwert von 10 Messungen zu jedem Zeitpunkt (0-24 h) für jeden gut. Bestimmen Sie Berechnungen mit Werten aus Schritt 7,8 Prozent-Verschluss. Erstellen Sie eine Tabelle am Ende der Tabelle mit dem Titel “breite Messung Averages” (Tabelle 3). Kopieren und einfügen, die die Durchschnittlichen 10 Messungen Zeile berechnet betreten “Breitenmessung im Durchschnitt” Tabelle 7.8. Einer anderen Tabelle neben der Breite Messung Durchschnitte -Tabelle zu erstellen. Titel dieser Tabelle Prozent Wunde Schließung (Tabelle 4).Hinweis: Der Wert in der Spalte 0 h für jedes gut sollte 0 sein, da die Kratzer 0 % an dem ersten 0 h Photo für alle Brunnen geschlossen ist. Navigieren Sie zu der nächsten Spalte über (4 h). Berechnen Sie die prozentuale Schließung für 4, 8, 12, 16, 20 und 24 h Zeitpunkte:wo X = prozentuale Schließung, ich = kratzen Ausgangsbreite (0 h Breite), f = final Scratch Breite (4, 8, 12, 16, 20 oder 24 h Breite). Gut breite durchschnitten 0 h 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h 1a 2a 3a 4a 1 b 2 b 3 b 4 b 1c 2c 3c 4c Tabelle 3. Im Durchschnitt Breitenmessung Tabellenformat. Diese Tabelle zeigt die Organisationsstruktur für die breite Messung Durchschnittswerte errechnet die rohen breite Messungen in Tabelle 2. Gut 0 h 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h 1a 0 2a 0 3a 0 4a 0 1 b 0 2 b 0 3 b 0 4 b 0 1c 0 2c 0 3c 0 4c 0 Tabelle 4. Prozent Wunde Schließung Tabellenformat. Diese Tabelle zeigt die Organisationsstruktur für die prozentuale Wunde Schließung Werte berechnet die breite Messen im Durchschnitt in Tabelle 3. Einer anderen Tabelle neben der Prozent Wound Closure -Tabelle zu erstellen. Titel dieser Tabelle AUC (Tabelle 5). Berechnen Sie die 0-4 h Fläche unter der Kurve (AUC) Wert in der 0-4 h Spalte für jede Vertiefung:wo X = 0-4 h AUC-Wert, a = % Schließung Wert für 0 h, b = % Schließung Wert für 4 h, h = die Zeit zwischen den beiden Maßnahmen (4 h in dieser Studie). Berechnen Sie die 4-8 h-Fläche unter der Kurve (AUC) Wert in der Spalte 4-8 h für jedes gut:Wo X = 4-8 h AUC-Wert, ein = % Schließung Wert für 4 h, b = % Schließung Wert für 8 h, h = die Zeit zwischen den beiden Maßnahmen (4 h in dieser Studie).Hinweis: Ein AUC-Wert sollte für jedes Zeitintervall 4 h 24 h Zeitraum für jedes gut berechnet werden. Summe aller die AUC-Werte von 0-24 Uhr (gerechnet in 7.10.1-7.10.2 Schritten) um einen summierten AUC-Wert für jedes gut erhalten. Stellen Sie sicher, dass diese Werte korrekt zur statistischen Auswertung gespeichert werden. Gut 0-4 h 4-8 h 8-12 h 12-16 Uhr 16-20 Uhr 20-24 Uhr Summierte AUC 1a 2a 3a 4a 1 b 2 b 3 b 4 b 1c 2c 3c 4c Tabelle 5. AUC Tabellenformat. Diese Tabelle zeigt die Organisationsstruktur für die AUC-Werte berechnet unter Verwendung der Prozent Wunde Schließung Werte in Tabelle 4. 8. statistische Analyse Bestimmen Sie die statistische Analyse-Methode, die am besten die Versuchsplanung und summierte AUC-Werte während des Tests erhalten.