Analizzando per polifosfato inorganico nei batteri

Polifosfato inorganico (polipo) è un biopolimero lineare delle unità di fosfato phosphoanhydride-collegato che si trova in tutti i domini di vita^1,2,3. In diversi batteri, polipo è essenziale per la risposta allo stress, motilità, formazione di biofilm, controllo del ciclo cellulare, antibiotico-resistenza e virulenza^{4,5,6,7,8 ,9,10,11}. Studi del metabolismo di polipo in batteri quindi hanno il potenziale per produrre intuizioni fondamentali la capacità dei batteri di causare malattia e prosperano in ambienti diversi. In molti casi, tuttavia, i metodi disponibili per quantificare polipo in cellule batteriche sono un fattore limitante in questi studi.

Ci sono diversi metodi attualmente utilizzati per misurare i livelli di polipo in materiali biologici. Questi metodi implicano in genere due fasi distinte: estrazione di polipo e quantificare il polipo presente in tali estratti. L’attuale metodo gold standard, sviluppato per il lievito Saccharomyces cerevisiae da Bru e colleghi¹², polipo estratti insieme a DNA e RNA usando fenolo e cloroformio, seguita dalla precipitazione dell’etanolo, il trattamento con desossiribonucleasi (DNasi) e ribonucleasi (RNasi) e la digestione del polyP purificato risultante con lo S. cerevisiae polipo-degradanti enzima exopolyphosphatase (ScPPX)¹³ a cedere gratis fosfato, che è poi quantificato utilizzando un analisi colorimetrica base verde di malachite. Questa procedura è altamente quantitativa ma alta intensità di lavoro, limitando il numero di campioni che possono essere elaborati in un singolo esperimento e non è ottimizzato per campioni batterici. Altri hanno segnalato estrazione polipo da una varietà di cellule e tessuti utilizzando perline (“glassmilk”) di silice o silice membrana colonne^{6,14,15,16,17, 18}. Questi metodi non estrarre in modo efficiente catena corta polipo (meno di 60 unità di fosfato)^12,14,15, anche se questo è di meno preoccupazione per i batteri, che sono pensati generalmente per sintetizzare principalmente Polipo della lungo-catena³. Vecchi metodi di estrazione di polipo con acidi forti^19,20 non più ampiamente sono usati, poiché il polyP è instabile in condizioni acide¹².

Ci sono anche una varietà di metodi segnalati per quantificare il polyP. Tra i più comuni è 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), una tintura fluorescente più tipicamente usata per macchiare il DNA. Complessi di DAPI-polipo hanno maxima di eccitazione e di emissione di fluorescenza diversi oltre DAPI-DNA complessi^21,22, ma c’è una notevole interferenza da altri componenti cellulari, tra cui RNA, nucleotidi e inositolo fosfati^12,15,16,23, riducendo la specificità e la sensibilità delle misurazioni di polipo effettuate utilizzando questo metodo. In alternativa, il polipo e adenosina difosfato (ADP) può essere convertiti in adenosina trifosfato (ATP) usando purificato Escherichia coli chinasi polipo (PPK) e l’ATP risultante quantificati tramite luciferasi^{14,17 ,18}. Questo permette la rilevazione di piccole quantità di polipo, ma richiede due fasi di reazione enzimatica e luciferina e ADP molto puro, che sono i reagenti costosi. In particolare il digest polipo in fosfato libero^6,12,13,24, che può essere rilevato utilizzando metodi più semplici, ma ScPPX è inibita da DNA e RNA¹², ScPPX trattamento della dnasi e RNasi che necessita di polipo-contenenti estratti. PPK, né ScPPX sono disponibili in commercio, e purificazione di PPK è relativamente complesso^25,26.

Polipo in lisati cellulari o estratti possa anche essere visualizzato su gel di poliacrilammide di DAPI^27,28,29,30, un metodo che permette la valutazione della lunghezza della catena, ma è la macchiatura negativa scarsamente quantitativa e bassa velocità.

Ora segnaliamo un saggio di polipo veloce, poco costoso, media-velocità di trasmissione che permette la rapida quantificazione del polyP livelli in diverse specie batteriche. Questo metodo inizia con la lisi delle cellule batteriche a 95 ° C in 4m guanidina isotiocianato (GITC)¹⁴ per inattivare cellulare fosfatasi, seguite da un’estrazione della colonna membrana silice ottimizzata per un’elaborazione rapida di campioni multipli. Il polipo-contenere l’Estratto risultante viene poi digerito con un grande eccesso di ScPPX, eliminando la necessità per il trattamento della dnasi e RNasi. Includiamo un protocollo per la purificazione di affinità nichel semplice di quantità di mg di ScPPX. Infine, fosfato libero polipo-derivato è quantificato con un saggio colorimetrico semplice, sensibile, basati su acido ascorbico²⁴ e normalizzato a proteine cellulari totali. Questo metodo semplifica la misurazione del polipo in cellule batteriche, e dimostriamo l’utilizzo con specie rappresentative di batteri gram-negativi, batteri Gram-positivi e micobatteri.