Ensayando para el polifosfato inorgánico en bacterias

Polifosfato inorgánico (pólipo) es un biopolímero lineal de unidades de fosfato phosphoanhydride-ligado que se encuentra en todos los ámbitos de la vida^1,2,3. En diversas bacterias, pólipo es esencial para la respuesta de estrés, motilidad, formación de biopelículas, control del ciclo celular, resistencia antibiótica y virulencia^{4,5,6,7,8 ,9,10,11}. Estudios de metabolismo del polyP en bacterias por lo tanto tienen el potencial para producir penetraciones fundamentales en la capacidad de las bacterias que causan enfermedad y prosperan en ambientes diversos. En muchos casos, sin embargo, los métodos disponibles para cuantificación de pólipo en las células bacterianas son un factor limitante en estos estudios.

Hay varios métodos usados actualmente para medir los niveles de pólipo en materiales biológicos. Estos métodos generalmente involucran dos pasos distintos: extracción de pólipos y cuantificar el pólipo presentes en esos extractos. El método estándar de oro actual, desarrollado para la levadura Saccharomyces cerevisiae por Bru y colaboradores¹², pólipo extractos junto con ADN y ARN con fenol y cloroformo, seguido por la precipitación del etanol, el tratamiento con Desoxirribonucleasa (DNasa) y ribonucleasa (Rnasa) y digestión del pólipo purificado resultante con la S. cerevisiae degradantes pólipo enzima exopolyphosphatase (ScPPX)¹³ fosfato libre, que luego se cuantifica mediante un ensayo colorimétrico basados en verde malaquita. Este procedimiento es altamente cuantitativa pero que requieren mucho trabajo, limitar el número de muestras que puede procesar en un solo experimento y no está optimizado para las muestras bacterianas. Otras personas han reportado extracción de pólipo de una variedad de células y tejidos utilizando granos de sílice “(glassmilk del) o silicona membrana columnas^{6,14,15,16,17, 18}. Estos métodos no extraer eficientemente pólipo (menos de 60 unidades de fosfato) de cadena corta^12,14,15, aunque esto está de menos preocupación por las bacterias, que generalmente se cree que sintetizan principalmente Pólipo de cadena larga³. Los métodos antiguos de extracción de pólipo usando ácidos fuertes^19,20 se ya no utilizan, ya que el pólipo es inestable bajo condiciones ácidas¹².

También hay una variedad de métodos reportados para la cuantificación del pólipo. Entre las más comunes es 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), un colorante fluorescente más típicamente usado para teñir ADN. Complejos de DAPI-pólipo tienen maxima de excitación y de emisión de fluorescencia diferentes a DAPI-ADN complejos^21,22, pero hay considerable interferencia de otros componentes celulares, incluyendo el ARN, nucleótidos y inositol los fosfatos^12,15,16,23, reducción de la especificidad y sensibilidad de las mediciones de pólipo realizadas con este método. Alternativamente, se pueden convertir en trifosfato de adenosina (ATP) mediante purificada Escherichia coli pólipo y Adenosín difosfato (ADP) cinasa de pólipo (PPK) y el ATP resultante cuantificadas usando luciferasa^{14,17 ,18}. Esto permite la detección de cantidades muy pequeñas de pólipo, pero requiere dos pasos de la reacción enzimática y luciferin y ADP muy puro, que son reactivos caros. ScPPX específicamente resúmenes de pólipo de fosfato libre^6,12,13,24, que pueden detectarse mediante métodos más simple, pero ScPPX es inhibida por el DNA y el RNA¹², necesidad tratamiento de DNasa y Rnasa de pólipo que contiene extractos. Ni PPK ni ScPPX están comercialmente disponibles, y purificación de PPK es relativamente complejo^25,26.

Pólipo en lysates de la célula o extractos también puede ser visualizado en geles de poliacrilamida por negativo^27,28,29,30, un método que permite la evaluación de la longitud de la cadena, pero es la coloración de DAPI bajo rendimiento y mal cuantitativa.

Ahora divulgamos un ensayo rápido, barato, medio rendimiento pólipo que permite la cuantificación rápida de pólipo niveles en diversas especies bacterianas. Este método comienza por lisis de las células bacterianas a 95 ° C de (GITC) el isotiocianato de guanidina 4 M¹⁴ para inactivar fosfatasas celulares, seguidas por una extracción de columna de membrana de sílice optimizada para el procesamiento rápido de múltiples muestras. El extracto que contiene el pólipo resultante luego se digiere con un exceso de ScPPX, eliminando la necesidad para el tratamiento de DNasa y Rnasa. Incluimos un protocolo para la purificación de afinidad níquel directa de cantidades de mg de ScPPX. Finalmente, derivado de pólipo libre fosfato es cuantificado con un ensayo colorimétrico simple, sensible, basada en el ácido ascórbico²⁴ y normalizado a la proteína celular total. Este método optimiza la medición del polyP en células bacterianas, y demostrar su uso con especies representativas de las bacterias Gram negativas, bacterias Gram-positivas y micobacterias.