Análise para inorgânico polifosfato em bactérias

Polifosfatos inorgânicos (pólipo) é um biopolímero linear de unidades phosphoanhydride-lig fosfato que é encontrado em todos os domínios da vida^1,2,3. Em diversas bactérias, pólipo é essencial para a resposta ao estresse, motilidade, formação de biofilmes, controlo do ciclo celular, resistência aos antibióticos e virulência^{4,5,6,7,8 ,9,10,11}. Estudos de metabolismo de pólipo em bactérias, portanto, têm o potencial de produzir insights fundamentais sobre a capacidade das bactérias que causam a doença e prosperam em ambientes diversos. Em muitos casos, no entanto, os métodos disponíveis para quantificação de pólipo em células bacterianas são um fator limitante nestes estudos.

Existem vários métodos atualmente usados para medir os níveis de pólipo em materiais biológicos. Esses métodos normalmente envolvem duas etapas distintas: extração de pólipo e quantificar o pólipo presentes nesses extratos. O método padrão ouro atual, desenvolvido para a levedura Saccharomyces cerevisiae por Bru e colegas¹², extractos de pólipo juntamente com DNA e RNA usando fenol e clorofórmio, seguido de precipitação do álcool etílico, tratamento com desoxirribonuclease (DNase) e ribonuclease (RNase) e a digestão do pólipo purificada resultante com S. cerevisiae pólipo-degradante enzima exopolyphosphatase (ScPPX)¹³ ao rendimento livre de fosfato, que é em seguida quantificado usando um ensaio colorimétrico baseado em verde malaquita. Este procedimento é altamente quantitativo mas trabalhoso, limitando o número de amostras que podem ser processados em uma única experiência e não é otimizado para amostras bacterianas. Outros relataram extraindo pólipo de uma variedade de células e tecidos usando esferas de sílica (“glassmilk”) ou sílica membrana colunas^{6,14,15,16,17, 18}. Esses métodos não eficientemente extrair cadeia curta pólipo (menos de 60 unidades de fosfato)^12,14,15, embora isso seja menos preocupante para as bactérias, que são pensados geralmente para sintetizar principalmente Pólipo de cadeia longa³. Antigos métodos de extração de pólipo usando ácidos fortes^19,20 são não mais amplamente utilizados, desde que o pólipo é instável sob condições ácidas¹².

Há também uma variedade de métodos relatados para quantificação de pólipo. Entre as mais comuns é ′ 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), um corante fluorescente mais normalmente usado para manchar o DNA. Complexos de DAPI-pólipo tem maxima de excitação e emissão de fluorescência diferentes de DAPI-DNA complexos^21,22, mas há considerável interferência de outros componentes celulares, incluindo o RNA, nucleotídeos e inositol fosfatos de^12,15,16,23, reduzindo a especificidade e a sensibilidade das medições de pólipo feito usando este método. Alternativamente, o pólipo e difosfato de adenosina (ADP) podem ser convertidas em adenosina trifosfato (ATP) usando purificada Escherichia coli quinase pólipo (PPK) e o ATP resultante quantificados usando luciferase^{14,17 ,18}. Isto permite a detecção de pequenas quantidades de pólipo, mas requer duas etapas de reação enzimática e luciferina e ADP muito puro, que são reagentes caros. ScPPX especificamente digere pólipo em fosfato livre^6,12,13,,²⁴, que pode ser detectada usando métodos mais simples, mas ScPPX é inibido por DNA e RNA¹², tratamento de DNase e RNase necessária de pólipo contendo extratos. PPK nem ScPPX estão disponíveis comercialmente, e purificação de PPK é relativamente complexo^25,26.

Pólipo no lisados celulares ou extratos também pode ser visualizado em gel de poliacrilamida por DAPI negativo coloração^27,28,29,30, um método que permite a avaliação do comprimento da corrente, mas é baixo rendimento e mal quantitativa.

Agora, nós relatamos um ensaio rápido, barato e de rendimento médio pólipo que permite rápida quantificação de pólipo níveis em diversas espécies bacterianas. Este método começa por lise de células bacterianas a 95 ° C, em 4 M guanidina isotiocianato (GITC)¹⁴ para inactivar fosfatases celulares, seguidos de uma extração de coluna de membrana de sílica otimizada para processamento rápido de amostras múltiplas. O extrato contendo pólipo resultante é então digerido com um grande excesso de ScPPX, eliminando a necessidade de tratamento de DNase e RNase. Nós incluímos um protocolo para a purificação de afinidade de níquel simples de quantidades de mg de ScPPX. Finalmente, fosfato livre derivado de pólipo é quantificado com um ensaio colorimétrico simples, sensível, à base de ácido ascórbico²⁴ e normalizado a proteína celular total. Este método simplifica a medição de pólipo em células bacterianas, e vamos mostrar seu uso com espécies representativas de bactérias Gram-negativas, bactérias gram-positivas e micobactérias.