JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Keuring voor anorganische polyfosfaat in bacteriën

Published: January 21, 2019
doi:
10.3791/58818
, , ,
1Department of Microbiology,University of Alabama at Birmingham, 2Division of Infectious Diseases,University of Alabama at Birmingham

Summary

Beschrijven we een eenvoudige methode voor snelle kwantificering van anorganische polyfosfaat in verschillende bacteriën, waaronder mycobacteriële, gram-negatieve en gram-positieve soorten.

Abstract

Anorganische polyfosfaat (poliep) is een biologische polymeer gevonden in de cellen in alle domeinen van het leven, en is vereist voor de virulentie en stressrespons bij vele bacteriën. Er zijn een aantal manieren om quantifying poliep in biologische materialen, waarvan vele zijn arbeidsintensief of ongevoelig, beperken hun nut. Wij presenteren hier een gestroomlijnde methode voor de kwantificering van de poliep in bacteriën, met behulp van een silica membraan kolom extractie geoptimaliseerd voor snelle verwerking van meerdere monsters, vertering van poliep met de poliep-specifieke exopolyphosphatase ScPPX, en detectie van de resulterende gratis fosfaat met een gevoelige ascorbinezuur gebaseerde colorimetrische test. Deze procedure is eenvoudig, goedkoop en betrouwbaar poliep kwantificering kan in verschillende bacteriesoorten. Wij presenteren representatieve poliep kwantificering van de gram-negatieve bacterie (Escherichia coli), de gram-positieve melkzuur-bacterie (Lactobacillus reuteri), en mycobacteriële soorten (Mycobacterium smegmatis). We voegen ook een eenvoudig protocol voor nikkel affiniteit zuivering van mg hoeveelheden van ScPPX, die nog niet commercieel beschikbaar.

Introduction

Anorganische polyfosfaat (poliep) is een lineaire biopolymeer van phosphoanhydride-linked fosfaat eenheden die wordt gevonden in alle domeinen van het leven1,2,3. In diverse bacteriën is poliep essentieel voor de stressrespons, beweeglijkheid, vorming van biofilms, celcyclus controle, antibioticaresistentie en virulentie4,5,6,7,8 ,9,10,11. Studies van de poliep metabolisme in bacteriën dus het potentieel hebben om opbrengst fundamentele inzichten in het vermogen van bacteriën om te leiden tot ziekte en gedijen in uiteenlopende omgevingen. In veel gevallen zijn de methoden die beschikbaar zijn voor de kwantificering van de poliep in bacteriële cellen echter een beperkende factor in deze studies.

Er zijn verschillende methoden die momenteel gebruikt voor het meten van de poliep in biologische materialen. Deze methoden zijn gewoonlijk twee afzonderlijke stappen: uitpakken van de poliep en kwantificeren van de poliep presenteren in deze extracten. De huidige methode van de goudstandaard, ontwikkeld voor de gist Saccharomyces cerevisiae door Bru en collega’s12, extracten poliep samen met DNA en RNA met behulp van fenol en chloroform, gevolgd door ethanol neerslag, behandeling met deoxyribonuclease (DNase) en ribonuclease (RNase), en de spijsvertering van de resulterende gezuiverde poliep met de S. cerevisiae poliep-vernederende enzym exopolyphosphatase (ScPPX)13 opbrengst gratis fosfaat, dat vervolgens wordt gekwantificeerd met behulp van een Malachiet groen-gebaseerd colorimetrische bepaling. Deze procedure is zeer kwantitatieve maar arbeidsintensief, beperking van het aantal monsters dat kan worden verwerkt in een één experiment, en is niet geoptimaliseerd voor bacteriële monsters. Anderen hebben gemeld poliep extraheren uit een verscheidenheid van cellen en weefsels met behulp van silica kralen (“glassmilk”) of silica membraan kolommen6,14,15,16,17, 18. Deze methoden doen niet efficiënt uitgepakt korte keten poliep (minder dan 60 fosfaat eenheden)12,14,15, hoewel dit van minder belang voor bacteriën, die over het algemeen gedacht zijn te synthetiseren voornamelijk lange-keten poliep3. Oudere methoden van poliep extractie met behulp van sterke zuren19,20 zijn niet langer gebruikte, omdat de poliep is onstabiel onder zure omstandigheden12.

Er zijn ook een aantal gerapporteerde manieren om quantifying poliep. Onder de meest voorkomende is 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), een fluorescente kleurstof meer meestal gebruikt om de vlekken van DNA. DAPI-polyP complexen hebben verschillende fluorescentie excitatie en emissie-maxima dan DAPI-DNA complexen21,22, maar er is aanzienlijke inmenging van andere cellulaire componenten, met inbegrip van RNA, nucleotiden en inositol fosfaten12,15,16,23, vermindering van de specificiteit en de gevoeligheid van de poliep metingen die worden uitgevoerd met behulp van deze methode. U kunt ook poliep en adenosinedifosfaat (ADP) kunnen worden omgezet in adenosine trifosfaat (ATP) met behulp van gezuiverde Escherichia coli poliep kinase (PPK) en de resulterende ATP gekwantificeerd aan de hand van luciferase14,17 ,18. Dit maakt de de ontdekking van zeer kleine hoeveelheden van de poliep, maar vereist twee stappen van de enzymatische reactie en zowel luciferine en zeer zuiver ADP, die dure reagentia. ScPPX specifiek verteert poliep in gratis fosfaat6,12,13,24, die kan worden opgespoord met behulp van de eenvoudiger methoden, maar ScPPX wordt geremd door DNA en RNA12, noodzakelijk DNase en RNase behandelingvan poliep-bevattende extracten. Noch PPK en ScPPX niet commercieel beschikbaar, en PPK zuivering is relatief complexe25,26.

Poliep in cel lysates of uittreksels kan ook worden gevisualiseerd op polyacrylamide gels door DAPI negatieve kleuring27,28,29,30, een methode die beoordeling van ketenlengte wel toegestaan, maar is lage-doorvoer en slecht kwantitatieve.

Nu melden we een snelle, goedkope en middellange-doorvoer poliep assay waarmee snelle kwantificering van de poliep niveaus in verschillende bacteriesoorten. Deze methode begint met het lysing van bacteriële cellen bij 95 ° C in 4 M guanidine isothiocyanaat (GITC)14 om de inactivering van cellulaire fosfatasen genaamd, gevolgd door een silica membraan kolom extractie geoptimaliseerd voor snelle verwerking van meerdere monsters. Het resulterende poliep-bevattende extract wordt dan met een grote overmaat van ScPPX, eliminerend de behoefte aan DNase en RNase behandeling verteerd. We nemen een protocol voor eenvoudige nikkel affiniteit zuivering van mg hoeveelheden ScPPX. Ten slotte is de poliep afkomstige gratis fosfaat gekwantificeerd met een eenvoudige, gevoelige, ascorbinezuur-based colorimetrische bepaling24 en genormaliseerd naar totale cellulaire eiwit. Deze methode stroomlijnt de meting van de poliep in bacteriële cellen, en wij tonen het gebruik ervan met de representatieve soorten van gram-negatieve bacteriën, gram-positieve bacteriën en mycobacteriën.

Protocol

1. het zuiveren van gist Exopolyphosphatase (ScPPX) Transformeer de E. coli eiwit overexpressie stam BL21(DE3)31 met plasmide pScPPX26 door electroporation32 of33van de chemisch te worden verwerkt. Inoculeer 1 L lysogenie Bouillon (LB) met 100 µg mL-1 ampicilline in een unbaffled kolf van 2 L met een één kolonie van BL21(DE3) met pScPPX2 en incubeer ‘s nachts bij 37 ° C zonder schudd…

Representative Results

De belangrijkste stappen van het protocol zijn routerplan in vereenvoudigde vorm in Figuur 1. Om aan te tonen het gebruik van dit protocol met gram-negatieve bacteriën, wild-type E. coli was MG165539 uitgegroeid tot halverwege log fase in de rijke medium LB bij 37 ° C met schudden (200 rpm), vervolgens gespoeld en een extra 2 h in ge¨ uncubeerd morpholinopropanesu…

Discussion

Het protocol hier beschreven vereenvoudigt en versnelt de kwantificering van de poliep niveaus in diverse bacteriën, met een typische set 24 monsters nemen ongeveer 1,5 h volledig verwerken. Dit maakt snelle screening van monsters en analyse van de mutant Bibliotheken, en vereenvoudigt de kinetische experimenten voor het meten van de accumulatie van poliep na verloop van tijd. We hebben aangetoond dat het protocol effectief op vertegenwoordigers van drie verschillende stammen werkt: proteobacteria, firmicutes, en Straal…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit project werd ondersteund door de Universiteit van Alabama in Birmingham departement microbiologie opstarten middelen en NIH grant R35GM124590 (naar MJG) en NIH subsidie R01AI121364 (FW).

Materials

E. coli BL21(DE3) Millipore Sigma 69450
plasmid pScPPX2 Addgene 112877 available to academic and other non-profit institutions
LB broth Fisher Scientific BP1427-2 E. coli growth medium
ampicillin Fisher Scientific BP176025
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Gold Biotechnology I2481C
HEPES buffer Gold Biotechnology H-400-1
potassium hydroxide (KOH) Fisher Scientific P250500 for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions
sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S27110
imidazole Fisher Scientific O3196500
lysozyme Fisher Scientific AAJ6070106
magnesium chloride (MgCl2) Fisher Scientific BP214-500
Pierce Universal Nuclease Fisher Scientific PI88700 Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute
Model 120 Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB-120 other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective
5 mL HiTrap chelating HP column GE Life Sciences 17040901 any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted
nickel(II) sulfate hexahydrate Fisher Scientific AC415611000 for charging HiTrap column
0.8 µm pore size cellulose acetate syringe filters Fisher Scientific 09-302-168
Bradford reagent Bio-Rad 5000205
Tris buffer Fisher Scientific BP1525
Spectrum Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO Fisher Scientific 08-667B other dialysis membranes with MWCO < 30,000 Da should also work
hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144-212 for adjusting the pH of Tris-buffered solutions
potassium chloride (KCl) Fisher Scientific P217500
glycerol Fisher Scientific BP2294
10x MOPS medium mixture Teknova M2101 E. coli growth medium
glucose Fisher Scientific D161
monobasic potassium phosphate (KH2PO4) Fisher Scientific BP362-500
dibasic potassium phosphate (K2HPO4) Fisher Scientific BP363-500
dehydrated yeast extract Fisher Scientific DF0886-17-0
tryptone Fisher Scientific BP1421-500
magnesium sulfate heptahydrate Fisher Scientific M63-50
manganese sulfate monohydrate Fisher Scientific M113-500
guanidine isothiocyanate Fisher Scientific BP221-250
bovine serum albumin (protease-free) Fisher Scientific BP9703100
clear flat bottom 96-well plates Sigma-Aldrich M0812-100EA any clear 96-well plate will work
Tecan M1000 Infinite plate reader Tecan, Inc. not applicable any plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work
ethanol Fisher Scientific 04-355-451
silica membrane spin columns Epoch Life Science 1910-050/250
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP120500
1.5 mL microfuge tubes Fisher Scientific NC9580154
ammonium acetate Fisher Scientific A637-500
antimony potassium tartrate Fisher Scientific AAA1088922
4 N sulfuric acid (H2SO4) Fisher Scientific SA818-500
ammonium heptamolybdate Fisher Scientific AAA1376630
ascorbic acid Fisher Scientific AC401471000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rao, N. N., Gomez-Garcia, M. R., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate: essential for growth and survival. Annual Review of Biochemistry. 78, 605-647 (2009).
  2. Achbergerova, L., Nahalka, J. Polyphosphate–an ancient energy source and active metabolic regulator. Microbial Cell Factories. 10, 63 (2011).
  3. Kornberg, A., Rao, N. N., Ault-Riche, D. Inorganic polyphosphate: a molecule of many functions. Annual Review of Biochemistry. 68, 89-125 (1999).
  4. Albi, T., Serrano, A. Inorganic polyphosphate in the microbial world. Emerging roles for a multifaceted biopolymer. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 32 (2), 27 (2016).
  5. Gray, M. J., Jakob, U. Oxidative stress protection by polyphosphate–new roles for an old player. Current Opinion in Microbiology. 24, 1-6 (2015).
  6. Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
  7. Racki, L. R., et al. Polyphosphate granule biogenesis is temporally and functionally tied to cell cycle exit during starvation in Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2440-E2449 (2017).
  8. Rashid, M. H., et al. Polyphosphate kinase is essential for biofilm development, quorum sensing, and virulence of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (17), 9636-9641 (2000).
  9. Candon, H. L., Allan, B. J., Fraley, C. D., Gaynor, E. C. Polyphosphate kinase 1 is a pathogenesis determinant in Campylobacter jejuni. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8099-8108 (2007).
  10. Richards, M. I., Michell, S. L., Oyston, P. C. An intracellularly inducible gene involved in virulence and polyphosphate production in Francisella. Journal of Medical Microbiology. 57 (Pt 10), 1183-1192 (2008).
  11. Singh, R., et al. Polyphosphate deficiency in Mycobacterium tuberculosis is associated with enhanced drug susceptibility and impaired growth in guinea pigs. Journal of Bacteriology. 195 (12), 2839-2851 (2013).
  12. Bru, S., Jimenez, J., Canadell, D., Arino, J., Clotet, J. Improvement of biochemical methods of polyP quantification. Microbial Cell. 4 (1), 6-15 (2016).
  13. Wurst, H., Kornberg, A. A soluble exopolyphosphatase of Saccharomyces cerevisiae. Purification and characterization. Journal of Biological Chemistry. 269 (15), 10996-11001 (1994).
  14. Ault-Riche, D., Fraley, C. D., Tzeng, C. M., Kornberg, A. Novel assay reveals multiple pathways regulating stress-induced accumulations of inorganic polyphosphate in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 180 (7), 1841-1847 (1998).
  15. Lee, W. D., et al. Simple Silica Column-Based Method to Quantify Inorganic Polyphosphates in Cartilage and Other Tissues. Cartilage. , (2017).
  16. Martin, P., Van Mooy, B. A. Fluorometric quantification of polyphosphate in environmental plankton samples: extraction protocols, matrix effects, and nucleic acid interference. Applied and Environmental Microbiology. 79 (1), 273-281 (2013).
  17. Cremers, C. M., et al. Polyphosphate: A Conserved Modifier of Amyloidogenic Processes. Molecular Cell. 63 (5), 768-780 (2016).
  18. Dahl, J. U., et al. The anti-inflammatory drug mesalamine targets bacterial polyphosphate accumulation. Nature Microbiology. 2, 16267 (2017).
  19. Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 2. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , 15-35 (2004).
  20. Werner, T. P., Amrhein, N., Freimoser, F. M. Novel method for the quantification of inorganic polyphosphate (iPoP) in Saccharomyces cerevisiae shows dependence of iPoP content on the growth phase. Archives of Microbiology. 184 (2), 129-136 (2005).
  21. Aschar-Sobbi, R., et al. High sensitivity, quantitative measurements of polyphosphate using a new DAPI-based approach. Journal of Fluorescence. 18 (5), 859-866 (2008).
  22. Kulakova, A. N., et al. Direct quantification of inorganic polyphosphate in microbial cells using 4′-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Environmental Science and Technology. 45 (18), 7799-7803 (2011).
  23. Kolozsvari, B., Parisi, F., Saiardi, A. Inositol phosphates induce DAPI fluorescence shift. Biochemical Journal. 460 (3), 377-385 (2014).
  24. Christ, J. J., Blank, L. M. Enzymatic quantification and length determination of polyphosphate down to a chain length of two. Analytical Biochemistry. 548, 82-90 (2018).
  25. Ahn, K., Kornberg, A. Polyphosphate kinase from Escherichia coli. Purification and demonstration of a phosphoenzyme intermediate. Journal of Biological Chemistry. 265 (20), 11734-11739 (1990).
  26. Zhu, Y., Lee, S. S., Xu, W. Crystallization and characterization of polyphosphate kinase from Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 997-1001 (2003).
  27. Smith, S. A., Morrissey, J. H. Sensitive fluorescence detection of polyphosphate in polyacrylamide gels using 4′,6-diamidino-2-phenylindol. Electrophoresis. 28 (19), 3461-3465 (2007).
  28. Livermore, T. M., Chubb, J. R., Saiardi, A. Developmental accumulation of inorganic polyphosphate affects germination and energetic metabolism in Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (4), 996-1001 (2016).
  29. Rudat, A. K., Pokhrel, A., Green, T. J., Gray, M. J. Mutations in Escherichia coli Polyphosphate Kinase That Lead to Dramatically Increased In Vivo Polyphosphate Levels. Journal of Bacteriology. 200 (6), e00697-e00617 (2018).
  30. Smith, S. A., Wang, Y., Morrissey, J. H. DNA ladders can be used to size polyphosphate resolved by polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. , (2018).
  31. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
  32. JoVE Science Education Database. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. , (2018).
  33. JoVE Science Education Database. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , (2018).
  34. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  35. JoVE Science Education Database. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , (2018).
  36. Mu, Q., Tavella, V. J., Luo, X. M. Role of Lactobacillus reuteri in Human Health and Diseases. Frontiers in Microbiology. 9, 757 (2018).
  37. Alcantara, C., Blasco, A., Zuniga, M., Monedero, V. Accumulation of polyphosphate in Lactobacillus spp. and its involvement in stress resistance. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1650-1659 (2014).
  38. Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 1. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , 3-13 (2004).
  39. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  40. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
  41. Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. The polyphosphate kinase gene of Escherichia coli. Isolation and sequence of the ppk gene and membrane location of the protein. Journal of Biological Chemistry. 267 (31), 22556-22561 (1992).
  42. Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. An exopolyphosphatase of Escherichia coli. The enzyme and its ppx gene in a polyphosphate operon. Journal of Biological Chemistry. 268 (1), 633-639 (1993).
  43. Rao, N. N., Liu, S., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate in Escherichia coli: the phosphate regulon and the stringent response. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2186-2193 (1998).
  44. van Pijkeren, J. P., Britton, R. A. High efficiency recombineering in lactic acid bacteria. Nucleic Acids Research. 40 (10), e76 (2012).
  45. Zhang, H., Ishige, K., Kornberg, A. A polyphosphate kinase (PPK2) widely conserved in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16678-16683 (2002).
  46. Sander, P., Meier, A., Bottger, E. C. rpsL+: a dominant selectable marker for gene replacement in mycobacteria. Molecular Microbiology. 16 (5), 991-1000 (1995).
  47. Hartman, S., Bont, J. A. M. D., Balows, A. . The Prokaryotes, a handbook on the biology of bacteria: ecophysiology, isolation, application. , 1215-1237 (1992).
  48. Winder, F. G., Denneny, J. M. The metabolism of inorganic polyphosphate in mycobacteria. Journal of General Microbiology. 17 (3), 573-585 (1957).
  49. Jankute, M., Cox, J. A., Harrison, J., Besra, G. S. Assembly of the Mycobacterial Cell Wall. Annual Review of Microbiology. 69, 405-423 (2015).
  50. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
  51. Cogan, E. B., Birrell, G. B., Griffith, O. H. A robotics-based automated assay for inorganic and organic phosphates. Analalytical Biochemistry. 271 (1), 29-35 (1999).

Tags

Inorganic PolyphosphateBacterial Stress ResponsePolyP ExtractionPolyP QuantificationLactobacillus ReuteriGITC Lysis BufferBradford AssayEthanol PrecipitationSilica MembraneTris-HCl BufferPhosphate Standards

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pokhrel, A., Lingo, J. C., Wolschendorf, F., Gray, M. J. Assaying for Inorganic Polyphosphate in Bacteria. J. Vis. Exp. (143), e58818, doi:10.3791/58818 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image